Crystal structure of caspase recruiting domain (CARD) of apoptosis repressor with CARD (ARC) och dess implikation vid hämning av apoptos

Crystal structure of ARC CARD

ARC hämmar både de inneboende och yttre apoptosvägarna via interaktion med olika apoptosrelaterade proteiner, inklusive Fas, fadd och caspase-8 (fig. 1A). ARC-KORTDOMÄNEN är känd för att störa SKIVBILDNING genom direkt interaktion med Fas DD, FADD DD och caspase-8 DEDs (Fig. 1A) 29.

kristallstrukturen på 2,4 kg för KORTDOMÄNEN för ARC (ARC CARD) löstes med hjälp av en anomalös diffraktion med en våglängd (SAD) och förfinades till ett Rwork på 17,0% och en Rfree på 20,0%. ARC-kortets högupplösta struktur visade att den består av fem spiraler, H1 till H5, vilket inte är den typiska vikningen för DD-superfamiljen (Fig. 1B). Intressant nog upptäcktes inte den sjätte spiralen (H6) på den typiska platsen, vilket indikerar att H6 kan vara flexibel i KORTDOMÄNEN för ARC eller anta en slingstruktur istället. Det fanns två monomerer i den asymmetriska enheten, kedja A och kedja B (Fig. 1C). Modellen av kedja a byggdes från rest 5 till Rest 87 och rest 91 till Rest 93, medan den för kedja B byggdes från rest 5 till Rest 84. Förmodad H6 (från rest 88 till 93) kunde inte modelleras på grund av den dåliga elektrondensitetskartan (Fig. 1B). Varje monomer var nästan identisk och överlagrad till en RMSD av 0.5 Msk (Tillägg Fig. 1). Även om en extraordinär form av H6 i KORTDOMÄNEN rapporterades med en NOD1-KORTSTRUKTUR, är detta den första rapporten som visar att H6 inte finns i KORTDOMÄNEN. Aminosyrasekvensen i H6-regionen i ARC CARD är inte en typisk helixsekvens jämfört med andra kort (Fig. 1D). Den förmodade H6-regionen för ARC-kort (PDPAWDWQH) förutspåddes vara en slumpmässig spolslinga baserad på det sekundära strukturförutsägelsesprogrammet, vilket indikerar att H6 inte existerar i ARC-kort och istället ersattes av en slinga. Denna atypiska struktur av KORTDOMÄNEN är det första fallet som observerats bland dödsdomänens superfamilj. Längden på H3 var kortare än för andra spiraler, vilket är ett vanligt kännetecken för death domain-superfamiljen. N-och C-termini av ARC-kort ligger på samma sida av molekylen. Helixbunten från H1 till H5 packades tätt av en central hydrofob kärna bestående av I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 och L77 (Fig. 1E). Rester begravda i kärnan som bildar det hydrofoba klustret av ARC-kort är inte väl bevarade, men är de vanligaste bland olika kort, vilket indikerar att ARC-kort kan vara ett av de mest kompakta och stabila proteinerna bland death domain-superfamiljen (Fig. 1D). Den mycket kompakta och beställda funktionen hos ARC-kort visas av den låga genomsnittliga B-faktorn på 57,9 Kub2(Tabell 1).

Tabell 1 datainsamling och förädlingsstatistik

den strukturella styvheten hos kärndelen av BÅGKORT och preliminärt störd H6-region av BÅGKORT är distinkta funktioner som kan vara kritiska för bågens funktioner, som förmedlas av olika interagerande proteiner inklusive TNF-receptorn, FADD, dålig och BAX. ARC CARD är den enda medlemmen i death domain-superfamiljen som kan interagera med olika underfamiljer inom superfamiljen såväl som med Bcl-2-familjeproteiner. Förhållandet mellan ARC: s kapacitet att rymma olika bindande partners och oordnad H6 med en styv kärna av ARC-kort bör undersökas i framtida studier.

dimergränssnitt inom ARC-kort

storlek-uteslutning kromatografi och multi-angle light scattering (MALS) indikerade att det isolerade ARC-kortet beter sig som en dimer i lösning (Fig. 2A). Den beräknade monomera molekylvikten för ARC CARD inklusive C-terminalen His-tag var 11.763 Da och den beräknade molekylvikten från MALS var 21.901 Da (0.9% passande fel), med en polydispersitet av 1.000 (Fig. 2A). Det har föreslagits att ARC kan bilda en homo-dimer via kortet och att KORTMEDIERAD dimerisering av ARC avskaffar dess anti-apoptotiska potential29. Vår kristallstruktur stöder också den dimeriska formen av ARC CARD i lösning. Dimeriseringen av dödsdomänens superfamilj inklusive kort är inte förvånande eftersom många studier har visat att DD-superfamiljen kan homo-dimeriseras i lösning24,33,34. Arc-kortets homo-dimeriska struktur ger intressant inblick i de homo-dimera gränssnitten. De två BÅGKORTEN i den asymmetriska enheten är packade som en asymmetrisk dimer med ett gränssnitt som huvudsakligen består av en elektrostatisk interaktion (Fig. 2B). Den totala dimerytan begraver 916 Cori2 (en monomeryta på 458 Cori2), vilket motsvarar 9% av dimerytan. De huvudsakliga interaktionskrafterna är saltbroar och vätebindningar, som är gjorda av D13 (på H1), R56 (på H4), R59 (på H4) och R60 (H4) från kedja A och av D32 (på H2), R37 (på H2), E46 (på H3) och D49 (på H3) från kedja B (Fig. 2B). Vid det perifera området bildar D13 på H1 och R60 på H4 i kedja a saltbroar med R37 på H2 respektive E46 på H3 I kedja B. I gränssnittets centrala region bildar R56 och R59 på H4 i kedja a saltbroar med D49 på H3 I kedja B. R59 i kedja a bidrar också till bildandet av en saltbro med D32 på H2 i kedja B. Interaktionsläget för ARC homo-dimer liknar det för det hetero-dimera komplexet mellan caspase – 9-kort och APAF-1-kort genom att H1 och H4 för en KORTMOLEKYL interagerar med H2 och H3 för den andra KORTMOLEKYLEN, främst via laddnings-laddningsinteraktioner 35. Denna typ av interaktion hör till typ i-interaktionen mellan de tre typerna av interaktioner som detekteras i dödsdomänen superfamily14,25. Även om en unik disulfidbindningsmedierad homo-dimerisk struktur av KORTDOMÄNEN inklusive NOD1 och CARMA1 har rapporterats33,34, dimeriserades den nuvarande strukturen för ARC-kortet via ett typ I-gränssnitt, vilket är en ny metod för homo-dimerisk KORTSTRUKTUR.

Figur 2

Dimeriskt gränssnitt för ARC-kortets struktur.

A. multi-vinkel ljusspridning (MALS) profil. Den röda linjen indikerar den experimentella molekylvikten. B. närbild av de interagerande resterna i gränssnittet mellan två monomerer. Spiraler är märkta och rester som är involverade i kontakten visas som pinnar. Saltbroar visas som streckade linjer.

för att analysera den nya homo-dimeriska strukturen av BÅGKORT bildad av stora elektrostatiska interaktioner genomförde vi storleksexklusionskromatografi och MALS-experiment i närvaro av högt salt (1,5 M NaCl) och lågt pH (pH 3), vilket resulterade i att karboxylaterna protonerades och de laddade interaktionerna stördes. Som förväntat blev ARC CARD en monomer vid höga salt-och låga pH-förhållanden (Fig. 3A och kompletterande Fig. 2A och 2B). Eftersom D49, R56 och R59 identifieras som kritiska rester för bildandet av detta nya gränssnitt, genomförde vi också en mutagenesstudie för att analysera gränssnittet. Varje Rest (D49, R56 och R59) muterades till motsatta laddningar och användes för storlek uteslutning kromatografi och MALS experiment. Såsom visas i Fig. 3B, elueringstoppen av den vilda typen som observerades vid uteslutning av storlekskromatografi flyttades till en monomer plats genom mutation. De molekylvikter som bestäms av MALS och förväntad stökiometri under olika betingelser sammanfattas i fig. 3C. Rådata för MALS visas också i kompletterande Fig. 2. Storleken uteslutning kromatografi och MALS experiment visade att det dimera BÅGKORTET blev en monomer via mutationer av gränssnittsrester d49r, R56E och R59E och dubbla mutanter (Fig. 3b och 3C och kompletterande Fig. 2). Förändringar i oligomerisering som svar på mutationer bekräftades av native-PAGE. Nedförskjutning av bandet genom mutationer indikerar att dimeriskt BÅGKORT blev monomeriskt i lösning som svar på mutationer (Fig. 3D). Generering av ett utstrykningsförskjutningsband med d49r-mutation var ett oväntat undantag som vi tror inträffade som svar på laddningsförändringar inducerade av mutagenes. Eftersom skiftade eller nyproducerade band på inbyggd sida är goda indikatorer på störningen eller bildandet av proteinkomplexet, kan bandet som genereras av D49R fortfarande vara ett monomerband. En annan möjlighet är att D49R bildar en dimer under koncentration. Vid hög koncentration blev svagt störd mutant D49R en dimer i lösning. Eftersom den dubbla mutanten, d49r, r59e, genererade ett monomerband (Fig. 3D), d49r kanske inte är tillräckligt för att störa laddade interaktioner. För att bekräfta att dimerstörning genom mutationer inte var ett resultat av oväntade strukturella förändringar orsakade av mutagenes, utan snarare på grund av specifika mutationer som kan störa det dimera gränssnittet, utvärderade vi far UV cirkulär dikroisk (CD) spektra (kompletterande Fig. S3). CD-spektra uppvisade typiska proteiner som är kopplade till en spiralformad typ av typ, med två uttalade minima vid 208 nm och 222 nm och en maxima vid 195 nm, som liknar den hos den vilda typen och matchade den molekylära strukturen hos andra medlemmar av DD-superfamiljen well36. Dessa resultat bekräftade att störning av BÅGKORTETS dimerisering orsakas av specifik mutagenes, som förväntat, men inte av de oväntade strukturella förändringarna som bildas av mutagenes.

Figur 3

analys av gränssnittet som bildas av homo-dimer av ARC-kort.

A. Storlek uteslutning kromatografiprofil av högt salt och lågt pH-tillstånd. B. storlek uteslutning kromatografi profil av olika mutationer. C. högt salt, lågt pH och mutationseffekter på dimerbildning. Uppmätt molekylvikt och förväntad stökiometri visas. D. Native-sida. Wt indikerar vild typ.

sammantaget bildar ARC-kort homo-dimer i lösning, som förväntat, vilket visades i ett tidigare in vivo-experiment29 och denna dimerisering förmedlas av typ i-interaktion med högladdade interaktioner detekterade i andra death domain-superfamiljeinteraktioner och hetero-dimera KORTDOMÄNINTERAKTIONER. Eftersom denna homo-dimerisering av ARC CARD orsakade förlusten av hämmande aktivitet hos ARC, är det möjligt att ARC CARD använder detta homo-dimera gränssnitt för att interagera med andra proteiner. Att avslöja proteininteraktionsgränssnittet som detekterades i vår nuvarande studie är avgörande för bestämning av Arcs funktion.

jämförelse med andra kortstrukturer

en strukturell homologisökning med DALI37 visade att ARC-kortet i hög grad liknar andra kort. De åtta bästa matcherna, som hade Z-poäng på 13,8 till 7,7, var NOD1, BinCARD, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 och RAIDD (Tabell 2). Överlagring av alla nio kort indikerade att strukturerna för alla kort är väl överlagrade genom H1 till H5, med undantag för H6, som inte ens upptäcktes i strukturen för ARC-kort (Fig. 4A). H6 av NOD1 kort är ansluten till H5 och inte kinked. H6 av de flesta kort är tätt packade i den centrala bunt, medan H6 av NLRP1 kort ligger långt från den centrala bunt (Fig. 4A).

Tabell 2 strukturell Likhetssökning med DALI

parvisa strukturella anpassningar mellan ARC CARD och dessa andra kort visade tydliga strukturella skillnader och likheter (Fig. 4B-G). Kortet bäst överlagrade med ARC-kort var NOD1. Innehav av atypisk H6 var ett intressant inslag i ARC-kort och NOD1-kort (Fig. 4B), medan H1 av ARC kort var längre än för andra kort. Baserat på fragmentresterna av ARC CARD, placeringen av trevande H6 liknar placeringen av H6 av NLRP1 (Fig. 4D). De iögonfallande skillnaderna i H6 indikerar den dynamiska karaktären hos H6 bland olika kort. Den böjda H1 detekteras i alla kortstrukturer, inklusive den nuvarande ARC kortet, är också en intressant funktion som bara upptäcktes på strukturen av kort.

ARC-kort har liknande bruttofunktioner i sin elektrostatiska yta som andra kort. Till exempel, i likhet med den laddade naturen hos de flesta andra kort, är ARC-KORTYTAN också sammansatt av en blandning av positivt och negativt laddade funktioner. De laddade klusterna ligger i gränssnittet för det homo-dimeriska komplexet. Eftersom kort är proteininteraktionsmoduler dikterar deras ytfunktioner deras sätt att interagera med partners. Baserat på analys av den elektrostatiska ytan av ARC CARD, det kan vara möjligt att använda denna laddade interaktion för homo eller hetero dimerisk komplex bildning.

konserverad yta av ARC-kort: potentiellt interaktionsställe med Fas DD och FADD DD för inhibering av SKIVAGGREGATET

ett antal rester på ytan av ARC-kortet som har identifierats som kritiska för bildandet av gränssnittet för det homo-dimera komplexet bevaras på Fas (DD), FADD (DED) och caspase-8 (Den första DED), vilka är kända bindningspartners för ARC (Fig. 5A). Dessa inkluderar D32, R37, D49, R56, R59 och R60 (Fig. 2B och 5A). D32 bevaras vid både Fas DD och FADD DD, medan D49 bevaras vid FADD DD och caspase-8 DED1 och R60 bevaras vid Fas DD och caspase-8 DED1. R37 och R59 bevaras endast vid FADD DD, medan R56 endast bevaras vid caspase-8 DED1. D13 och E46, som är kritiska rester för bildning av det homo-dimera komplexet av ARC CARD, bevaras inte alls (Fig. 5A).

Figur 5

modell av molekylär grund för hämning av SKIVBILDNING med BÅGKORT.

A. Sekvensinriktning av ARC-kort med dess bindande partners, Fas DD, FADD DD och caspase-8 DED. Rester som är kritiska för homo-dimerisk interaktion av ARC-kort var blå för ena sidan av ytan och röd för den andra sidan. Konserverade rester på Fas DD, FADD DD och caspase-8 DED visas också som rött eller blått. B. den övre panelen visar ett schematiskt diagram över de tre typerna av interaktioner i dödsdomänens superfamiljkomplex. DDS: död domän superfamilj. Bottenpanelen visar strukturen på caspase – 9-kortet (Casp-9)/Apaf-1-komplexet, ett representativt kort:KORTINTERAKTION bildad av typ i-interaktion. C. modell för interaktion mellan ARC CARD och Fas DD. Rester som kan delta i interaktionen visas som pinnar. D. modell för interaktion mellan ARC CARD och FADD DD. Rester som kan delta i interaktionen visas som pinnar.

tre typer av interaktioner (typ I, II och III) vid sex unika gränssnitt (typ Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa och IIIb) har identifierats i interaktionerna med death domain superfamily (Fig. 5B) 14,38. Den typiska heterodimera interaktionen med KORTDOMÄNEN identifierades av kristallstrukturen hos caspase-9-kort och APAF-1-KORTKOMPLEX och interaktionen bildades av typ i-interaktioner35. Typ Ia-ytan bildas främst av rester vid H1-och H4-spiralerna och interagerar med typ Ib-ytan, som huvudsakligen bildas av rester vid H2-och H3-spiralerna (Fig. 5B).

baserat på sekvensinriktningen, tidigare löst KORTKOMPLEXSTRUKTUR och placering av de konserverade resterna som är kritiska för bildandet av det homo-dimeriska komplexet av BÅGKORT, utvecklade vi en preliminär hämmande modell av BÅGKORT genom att interagera med Fas DD eller FADD DD. Eftersom D13, R56, R59 och R60, som är kritiska rester för bildandet av en sida av homo-dimera gränssnittet för ARC-kort, inte är relativt bevarade vid Fas DD och FADD DD, användes denna sida av ARC-kort som en preliminär interaktionsplats. Fas DD eller FADD DD överlagrades sedan på ARC-kortet på andra sidan för att göra en typ i-interaktion. ARC: Fas-komplexmodellen visade att R56, R59 och R60 från ARC-kort bildar en massiv laddad interaktion med D261 och E256 från Fas DD (Fig. 5C). D13 av ARC-kort kan också vara involverad i interaktionen genom att bilda en saltbro med K301 av Fas DD. I fallet med ARC: FADD-komplexmodellen kan D123 och D127 från H3 av FADD DD ha deltagit i interaktionen med grundplåstret (bildat av R56, R59 och R60) av ARC-kort (Fig. 5D). Gränssnitten för modellstrukturerna var strukturellt och energiskt gynnsamma enligt PISA-gränssnittsanalysprogrammet39.

den första homo-dimera KORTSTRUKTUREN för båge och uppföljningsstudier tyder på en BÅGMEDIERAD molekylär hämmande mekanism för SKIVAGGREGATET, vilket är det kritiska signalmolekylkomplexet i den yttre apoptossignalvägen. Eftersom det multimera KORTDOMÄNKOMPLEXET av RIG-1 och MAVS, som använder alla tre typer av interaktioner som har detekterats för montering av underfamiljen death domain, rapporterades nyligen, kan det faktum att ARC CARD bildar ett högre oligomerkomplex med Fas DD eller FADD DD under inhiberingsprocessen inte ignoreras. I detta fall kan en omfattande yta av BÅGKORT med rester som sprider sig genom alla fem spiralerna i dess struktur ha deltagit i montering av det hämmande komplexet. Ytterligare ansträngningar för att lösa den komplexa strukturen behövs för att få tydligare inblick i den molekylära grunden för hämning av ARC. Det har emellertid rapporterats att homo-dimerisering av ARC-kort orsakade förlust av hämmande aktivitet hos ARC, vilket indikerar att vår föreslagna modell av komplexen med Fas DD och FADD är korrekt. Att avslöja proteininteraktionsgränssnittet detekterat i den aktuella studien kan vara avgörande för interaktionen med andra bindningspartners för korrekt hämmande funktion av ARC under apoptos och nekroptos.

ARC uttrycks tydligt i hjärt-och skelettmuskelceller och förhindrar apoptotisk celldöd hos de postmitotiska muskelcellerna. Involvering av ARC i kardiomyopati under stressförhållanden observerades i en musmodell40, vilket indikerar att ARC kan vara tätt kopplad till hjärtsjukdomar hos människor. Hämmande funktion av neuronal celldöd av ARC rapporterades också i en musstudie41, vilket indikerar att ARC kan vara avgörande för neurodegenerativa sjukdomar hos människor. Högt uttryck av ARC observeras ofta i maligna tumörer, vilket indikerar att det kan vara väsentligt för tumörutveckling och progression. I denna aspekt kan ARC vara en kritisk molekyl som kan kontrollera apoptotisk och nekrotisk celldöd; följaktligen leder misslyckande med att kontrollera ARC-funktionen till dödlig sjukdom hos människor. Därför kan ARC vara ett bra mål för terapeutisk intervention och ARC CARD-strukturen som presenteras i denna studie kan vara det första steget för att förstå ARC CARD-medierade proteininteraktioner och dess hämmande kapacitet. Små molekyler som kan styra Arcs aktivitet genom att rikta in sig på homo – och hetero – oligomergränssnittet kan vara bra regulatorer av apoptotisk och nekrotisk celldöd och därmed potentiella läkemedelskandidater.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.