Lidský BRM protein se štěpí během apoptózy: role katepsinu G

výsledky a diskuse

léčba buněk NB-4 s UV zářením způsobuje štěpení hbrm a PARP (obr. 1A) a fragmentace DNA (údaje nejsou zobrazeny). PARP je známý substrát apoptotických kaspáz (18). Protein hbrm 180-kDa se štěpí na menší produkt 160-kDa rychlostí téměř totožnou s rychlostí štěpení PARP. Léčba buněk NB4 látkami poškozujícími DNA (etoposid nebo kamptothecin)nebo staurosporin také indukovala apoptózu a štěpení hbrm na fragment 160-kDa (obr. 1B). Anti – hbrm protilátky zvýšené proti amino konci hbrm jsou schopny detekovat fragment hbrm 160-kDa (obr. 1), zatímco anti-hbrm protilátky zvýšené proti karboxylovému konci hbrm nerozpoznají tento fragment 160-kDa (údaje nejsou zobrazeny). Tyto výsledky naznačují, že karboxylový konec hbrm byl odstraněn apoptotickým štěpením.

Obrázek 1

proteiny brm a PARP jsou degradovány v buňkách NB4 podstupujících apoptózu. (A) buňky NB4 byly ošetřeny 100 J / m2 UV a poté lyzovány v časech po ošetření uvedených nad pruhy. Buněčné lyzáty byly použity pro západní blotování anti-brm a anti-PARP protilátkami. (B) buňky byly ošetřeny po dobu 2 hodin etoposidem, kamptothecinem nebo staurosporinem v uvedených koncentracích a poté lyzovány pro západní blotování.

obecně se předpokládá, že jaderné apoptotické substráty, jako je hbrm, jsou štěpeny“ efektorovými “ kaspázami, jako je kaspáza-3 nebo kaspáza-7, které jsou aktivovány v konečných krocích apoptózy a vstupují do jader, aby štěpily proteinové substráty. K určení, zda kaspáza-3 nebo kaspáza-7 dokázala štěpit hbrm protein, byla izolovaná jádra HeLa inkubována buď s aktivní purifikovanou kaspázou-3 nebo kaspázou-7. Jádra byla poté odpuzována a použita k výrobě extraktů jaderných bílkovin. Jaderné extrakty byly použity pro západní bloty s protilátkami proti třem proteinům, o nichž je známo, že se štěpí in vivo během apoptózy: PARP, DNA-dependentní kináza (DNA-PK) 350-kDa podjednotka a protein NuMA, stejně jako pro hbrm westerny. Ačkoli kaspáza-7 řezá PARP a DNA-PK p350 rychleji než kaspáza-3, kaspáza-3 i kaspáza-7 řezají všechny tři jaderné apoptotické substráty (obr. 2A). Hbrm protein však nebyl štěpen ani kaspázou-3, ani kaspázou-7(nebo kaspázou-6, nezveřejněné údaje). I když se jedná o systém in vitro, naznačuje to, že hbrm je štěpen jinou proteázou, která je buď schopna vstoupit do jádra během apoptózy, nebo se nachází v jádru.

Obrázek 2

inkubace jader hela buněk s purifikovanými aktivními kaspázami a katepsiny. A) jádra hela buněk byla připravena a resuspendována ve 100 µl homogenizačního pufru, jak je popsáno v materiálech a metodách. Potom se do každého vzorku 100 µl přidá 100 ng purifikované aktivní kaspázy-3 nebo kaspázy-7 a vzorky se inkubují při 30°C po dobu uvedenou nad pruhy. Kontrolní vzorky byly inkubovány 2 hodiny při 30°C bez přidané kaspázy. Bezprostředně po inkubaci byla jádra odpuzována a poté lyzována v malém objemu lyzačního pufru Nonidet P-40 po dobu 30 minut při 4°C. Lyzáty Nonidetu P-40 byly odstraněny z DNA spřádáním 10 minut při 10 000 × g a poté použity pro západní blotování. (B) jádra HeLa byla inkubována při 30°C po dobu 2 hodin v pufru, hela cytosolu nebo NB4 cytosolu, jak je uvedeno nad pruhy. C) jádra byla inkubována s pufrem, purifikovaným katepsinem G, katepsinem D nebo elastinem, jak je uvedeno.

protože hbrm protein je štěpen během apoptózy v buňkách NB4, ale není štěpen obvyklými efektorovými kaspázami, zdálo se možné, že hbrm byl štěpen proteázou specifickou pro buňky NB4. Pro testování této hypotézy byla jádra HeLa inkubována cytosolem bez detergentu z neošetřených buněk NB4 nebo buněk HeLa. Obr. 2B ukazuje, že pouze cytosol NB4 obsahoval aktivitu, která štěpila protein hbrm. Jiné proteázy než kaspázy se podílely na provádění apoptózy v buňkách NB4 nebo neutrofilech, včetně katepsinů (19, 20), ačkoli katepsiny dříve neprokázaly štěpení jaderných substrátů. Aby se zjistilo, zda neutrofilní proteázy měly nějaký účinek na štěpení hbrm, byla jádra HeLa inkubována s čištěným katepsinem D, katepsinem G nebo elastinem. Pouze katepsin G byl schopen štěpit hbrm (obr. 2C); katepsin G téměř úplně snížil protein hbrm na fragment 160-kDa, velmi podobný velikosti jako u cytosolu NB4 a pozorovaný in vivo během apoptózy. K ověření, že katepsin G byl přítomen v cytosolu NB4 a byl zodpovědný za štěpení hbrm, byl cytosol NB4 deplecí katepsinu G opakovanou imunoprecipitací; výsledný ochuzený cytosol byl mnohem méně aktivní na hbrm, když byl inkubován s jádry HeLa (nepublikovaná data).

k určení, zda je katepsin G nezbytný pro štěpení hbrm in vivo, byly buňky NB4 předem ošetřeny buď specifickým inhibitorem katepsinu G CK-08 (karbobenzoxy-glycyl-leucyl-fenylalanyl-chlormethylketonem) nebo obecnějším inhibitorem serinové proteázy l-1-tosylamido-2-fenylethylchlorethylketonem. Buňky byly poté ozářeny UV zářením a inkubovány další 4 h. lyzáty buněčného vzorku byly poté analyzovány Western blot (obr. 3). Jak je znázorněno v horní části obr. 3, inhibitor katepsinu G CK-08 téměř úplně zablokoval štěpení hbrm v reakci na UV záření, zatímco l-1-tosylamido-2-fenylethylchormethylketon měl malý účinek. Je také zřejmé, že CK-08 nepůsobí blokováním nějakého upstream kroku apoptotické odpovědi, jako je aktivace kaspázy. Jak je znázorněno ve spodní části obr. 3, CK-08 nejenže blokuje aktivaci kaspázy v reakci na UV záření, ale CK-08 sám, na rozdíl od l-1-tosylamido-2-fenylethylchormethylketonu, je silným aktivátorem kaspáz. Kaspáza-9, kaspáza-3 (obr. 4) a kaspáza-7 (není zobrazena) jsou všechny štěpeny a aktivovány v buňkách léčených samotným CK-08 nebo CK-08 s následným UV zářením. Protein PARP je také štěpen ze 112 kDa na 85 kDa v buňkách ošetřených CK-08, což ukazuje, že aktivované kaspázy vstupují do jádra v těchto buňkách (obr. 3). Tyto výsledky naznačují, že CK-08 musí buď přímo blokovat štěpení katepsinu G hbrm, nebo blokovat nějakou alternativní apoptotickou dráhu, která je závislá na aktivitě katepsinu G a nezahrnuje kaspázy. Vzhledem ke skutečnosti, že purifikovaný katepsin G štěpí hbrm in vitro podobným způsobem, jaký byl pozorován in vivo, se zdá, že předchozí možnost je pravděpodobnější.

obrázek 3

vliv inhibitorů serinových proteáz na štěpení hbrm a aktivaci kaspáz. Buňky NB4 byly ponechány neošetřené, předléčeny po dobu 30 minut 5 µM inhibitorem katepsinu G CK-08 (Z-Gly-Leu-Phe-CK) nebo předléčeny po dobu 30 minut obecnějším inhibitorem serinové proteázy l-1-tosylamido-2-fenylethylchloremethyl ketonem (TPCK), jak je uvedeno nad pruhy. Neošetřené a inhibitory ošetřené vzorky byly poté ozářeny UV zářením a inkubovány další 4 hodiny (s inhibitory proteázy přidanými zpět do příslušných vzorků). Celé buněčné lyzáty byly poté připraveny tak, jak je popsáno v materiálech a metodách, a použity pro analýzu Western blot s protilátkami proti proteinům uvedeným vlevo.

obrázek 4

endogenní štěpení myších BRM je zesíleno nadměrnou expresí lidského katepsinu G v myších 32D buňkách. (A) myší 32D buňky stabilně transfektované buď prázdným vektorem nebo vektorem exprimujícím lidský katepsin G byly ozářeny UV zářením a poté lyzovány v časech po ozáření uvedených nad pruhy. Buněčné lyzáty byly poté použity pro analýzu Western blot s protilátkami proti katepsinu G. (B) 32D lyzáty ze stejného experimentu ukázaného V A byly použity pro analýzu Western blot s anti-hbrm protilátkami. Jsou uvedeny polohy endogenního myšího BRM v plné délce (180 kDa) a štěpného produktu (160 kDa).

aby se potvrdilo, že exprese katepsinu G ovlivňuje štěpení hbrm in vivo, bylo štěpení hbrm zkoumáno v myších myeloidních 32D buněčných liniích (21)stabilně transfektovaných buď prázdným vektorem nebo vektorem exprimujícím lidský katepsin G (obr. 4A). 32D buňky, stejně jako jiné buňky závislé na IL-3, nebudou podrobeny úplné apoptóze, pokud nebudou hladovět pro IL-3 (22); v přítomnosti IL-3 vstoupí 32D buňky vystavené UV záření do raných stádií apoptózy a poté se zotaví. Obr. 4B ukazuje endogenní myší hladiny brm v 32D buňkách po UV záření, ale bez hladovění IL-3. 32D buňky transfekované lidským katepsinem G mají zjevně nižší hladiny endogenního brm v plné délce (180 kDa) a vyšší hladiny produktu štěpení brm (160 kDa); to je zřejmé za všech podmínek.

pokud katepsin G skutečně štěpí hbrm in vivo, musí se uvolnit z granulí a mít přístup k jaderným proteinům. Pro pozorování subcelulární distribuce katepsinu G v buňkách NB4 byly buňky spřádány na sklíčka, poté byly použity protilátky proti katepsinu G a LysoTracker (LysoTracker je fluorescenční buněčný propustný peptid, který se selektivně hromadí v kyselých organelách, jako jsou lysosomy). Jak je znázorněno na obr. 5A, protilátky proti katepsinu G velmi intenzivně barví specifické struktury v buňkách NB4. Struktura podobná čepici, která je obarvena protilátkami proti katepsinu G, ale ne Lysotrackerem, je pravděpodobně Golgiho aparát. Menší kruhové oblasti jsou téměř jistě granule, protože se v nich také hromadí lysotracker peptid (viz obr. 5A). Jak ukazuje barvení DAPI, buňky NB4 obsahují velmi velká jádra a relativně malý objem cytoplazmy. Jako kontrola byly buňky HeLa-S3, které rostou v suspenzi a mají podobnou velikost a tvar jako buňky NB4, také obarveny protilátkami proti katepsinu G. Jak je vidět na obr. 5B, není pozorováno téměř žádné barvení buněk HeLa-S3 protilátkami proti katepsinu G. K určení, zda katepsin G prochází během apoptózy jakoukoli změnou subcelulární polohy, byly buňky NB4 ozářeny UV zářením. Po 1 h byl do ozářených buněk přidán LysoTracker; po jedné další hodině byly buňky roztočeny na sklíčka a fixovány. Buňky byly obarveny pomocí protilátek proti katepsinu G a poté namontovány s médiem obsahujícím DAPI. Apoptotické buňky byly identifikovány podle jejich nepravidelného tvaru a kondenzovaného chromatinu. Jak ukazuje shlukované barvení DAPI, obr. 5C ukazuje dvě apoptotické buňky NB4. Ve srovnání s obr. 5A, vzorec barvení katepsinu G I Lysotrackeru je jasně odlišný, stává se difúznějším a je spojen s jádrem. Tato změna subcelulární distribuce 2 h po ozáření podporuje myšlenku, že struktura granulí je během apoptózy narušena a granulové proteiny, jako je katepsin G, se mohou pohybovat do jádra a štěpit jaderné proteiny.

obrázek 5

barvení buněk NB4 a HeLa-S3 protilátkami proti katepsinu G nebo Lysotrackerem. (A) buňky NB4 byly inkubovány po dobu 1 hodiny při 37°C v médiu obsahujícím 50 µM lysotracker peptidu a poté se roztočily na sklíčka pomocí cytocentrifuge. Po fixaci v neutrálně pufrovaném formalinu s následným promytím byly buňky inkubovány nejprve protilátkami proti katepsinu G a poté sekundárními protilátkami značenými FITC. Buňky byly připraveny pro prohlížení pod mikroskopem přidáním montážního média obsahujícího DAPI a krycí sklíčka. Fotografie ukazují barvení DAPI plus katepsin G, DAPI plus LysoTracker, samotný DAPI, samotný katepsin G nebo samotný LysoTracker, jak je uvedeno. B) buňky HeLa-S3 byly připraveny jako v A, ale nebyly inkubovány s Lysotrackerem. C) buňky NB4 byly ozářeny UV zářením, jak je popsáno v materiálech a metodách; 1 h po ozáření byl do buněčného média přidán 50 µM LysoTracker. Po další hodině inkubace byly buňky otočeny na skleněné sklíčko. Po fixaci a barvení protilátkami proti katepsinu G byly buňky namontovány pomocí média obsahujícího DAPI. Tvar buněk a kondenzace chromatinu byly použity k odlišení apoptotických od neapoptotických buněk.

ačkoli se zdá, že katepsin G se podílí na štěpení hbrm v buňkách NB4, katepsin G je normálně exprimován pouze v určitých myeloidních buňkách (neutrofily, makrofágy, žírné buňky a jejich prekurzory). To vyvolává otázku změn hladin hbrm pozorovaných u jiných typů buněk. Obr. 6 představuje důkaz, že hbrm může být degradován proteazomovou aktivitou. Specifický inhibitor proteazomu lactacystin způsobuje zvýšení hladin proteinu hbrm v buňkách NB4 i COS-7 (obr. 6A), což naznačuje, že v obou typech buněk existuje bazální rychlost ubikvitinace a degradace hbrm. Aby se ověřilo, že hbrm je ubikvinován, byly buňky COS-7 kotransfektovány plazmidy exprimujícími HBRM označený HA a ubikvitin označený 6-His. Lyzáty z transfekovaných buněk byly poté inkubovány agarosou kyseliny Ni-nitrilotrioctové a vázané proteiny eluovány a použity pro analýzu Western blot s anti-HA protilátkami. Hbrm se váže na agarózu kyseliny Ni-nitrilooctové, ale pouze tehdy, když byl plazmid hbrm značený HA kotransfektován plazmidem 6-his-ubichitin (obr. 6B). Výsledky popsané výše naznačují, že degradace hbrm v buňkách bez katepsinu G a možná degradace hbrm v buňkách NB4, ke které dochází po štěpení katepsinem G, je zprostředkována proteazomem. Zdá se, že úroveň ubikvitinylace hbrm se po UV záření nezvyšuje (naše nezveřejněná data); to však nutně neznamená, že cesta ubiqutinu není při degradaci hbrm důležitá. Jiné skupiny (24, 25) navrhly apoptotickou degradaci zprostředkovanou proteazomy, ale neprokázaly detekovatelné zvýšení ubikviovaného substrátu během apoptózy. Je možné, že apoptóza vede ke zvýšené aktivitě jak ubikvinujících enzymů, tak proteazomových proteáz, což způsobuje rychlejší degradaci bílkovin bez detekovatelného zvýšení ubikvinovaného proteinu.

obrázek 6

proteazom se podílí na degradaci hbrm. (A) buňky NB4 nebo buňky COS-7 byly ošetřeny 20 µM laktacystinem po dobu 4 hodin nebo ponechány neléčené. Buňky byly poté lyzovány pro západní analýzu. (B) COS-7 buňky byly transfektovány buď ha-značeným hbrm plazmidem plus prázdným vektorem nebo Ha-značeným hbrm plazmidem plus vektorem exprimujícím 6 – his Ubichitin, jak je uvedeno nad pruhy. Oba vzorky buněk byly lyzovány, inkubovány s agarosou kyseliny Ni-nitrilotrioctové pro vazbu proteinů značených 6-His a poté navázané proteiny eluovány 150 mM EDTA. Eluované proteiny byly použity pro analýzu Western blot s protilátkami anti-HA tag.

protože se zdá, že jak katepsin G, tak proteazom se podílejí na štěpení hbrm v buňkách NB4, vyvstává otázka, jakou roli hraje každá z nich při degradaci katepsinu G in vivo. Oblast karboxylového konce odstraněná štěpením katepsinu G obsahuje bromodomain (obr. 7A), o kterém se předpokládá, že zprostředkovává interakci protein-protein (9). To naznačuje, že štěpení hbrm může narušit normální interakce mezi hbrm a jinými jadernými proteiny. K určení, zda štěpení katepsinu G ovlivňuje asociaci proteinu hbrm s jadernými strukturami, byly použity subcelulární frakcionační experimenty ke zkoumání míry, do jaké byl hbrm v plné délce na rozdíl od fragmentu hbrm 160-kDa schopen zůstat spojen s jádrem. Buňky NB4 byly ozářeny UV zářením a poté byly v různých časech frakcionovány na cytosol a jádra rychlou lýzou detergentů, jak je popsáno v materiálech a metodách (obr. 7B). Na rozdíl od plné délky 180-kDa hbrm, kde většina proteinu zůstala pevně spojena s jádrem, byl v cytosolu nalezen veškerý detekovatelný fragment 160-kDa hbrm (obr. 7B). To je na rozdíl od fragmentu APOPTOTICKÉHO štěpení PARP 85-kDa, který zůstává v jádru. Tyto výsledky jasně ukazují, že štěpení ≈20 kDa z karboxylového konce hbrm má za následek narušení interakce mezi hbrm a některým jiným jaderným proteinem, což vede ke ztrátě těsné vazby s jádrem. Může také vést ke zvýšení dostupnosti proteazomu, což usnadňuje další apoptotickou degradaci. Je rozumné předpokládat, že hbrm musí být spojen s jinými jadernými proteiny v chromatinu, aby mohl vykonávat svou normální funkci, a tento model je podporován studiemi asociace BRG-1 s chromatinem (15). Protein BRG-1 je vysoce homologní s hbrm, a když jsou lymfocyty stimulovány buď ionomycinem nebo phorbol 12-myristát 13-acetát, BRG-1 se stává těsněji spojen s chromatinem.

Obrázek 7

fragment štěpení hbrm 160-kDa je méně silně spojen s jinými jadernými proteiny než hbrm v plné délce. (A) schéma domén hbrm a místa štěpení katepsinu G. (B) buňky NB4 byly ozářeny UV zářením a poté v různých časech po irradaci byly buňky frakcionovány na cytosol a jádra rychlou lýzou detergentů(viz materiály a metody). Obě frakce byly použity pro analýzu Western blot s anti-hbrm a anti-PARP protilátkami.

stručně řečeno, buňky NB4 reagují jak na UV záření, tak na léčbu staurosporinem rychlým štěpením karboxylového terminálu 20 kDa proteinu hbrm obsahujícího bromodomain, což vede ke ztrátě těsné vazby s jadernými strukturami. Na rozdíl od většiny jaderných apoptotických substrátů není hbrm štěpen kaspázou-3, -6 nebo -7. Serinová proteáza katepsin G štěpí hbrm in vitro a inhibitor katepsinu G, ale ne jiné inhibitory serinové proteázy, může blokovat UV-indukované štěpení hbrm in vivo. Indukovaná nadměrná exprese lidského katepsinu G v myších 32D buňkách zvyšuje úroveň štěpení hbrm pozorované po UV záření. Tyto výsledky naznačují, že hbrm se štěpí v buňkách NB4 katepsinem G uvolněným z buněčných granulí během apoptózy. Také jsme pozorovali, že katepsin G štěpí proteiny PARP, NuMA a DNA-PK p350 in vitro (nepublikovaná data). Na rozdíl od výsledků pozorovaných u hbrm je však vzorec trávení odlišný od vzorce pozorovaného in vivo. Vzorec trávení těchto proteinů in vivo se místo toho podobá vzorci generovanému in vitro kaspázami. Kromě toho není štěpení PARP in vivo blokováno inhibitorem katepsinu G CK-08 (obr. 3). Z těchto důvodů se domníváme, že jaderné apoptotické substráty PARP, NuMA a DNA-PK p350 jsou na rozdíl od hbrm štěpeny in vivo kaspázou-3 nebo -7.

výše uvedená diskuse naznačuje, že některé hematopoetické buňky, jako jsou neutrofily, mohou mít jedinečnou metodu pro rychlou inaktivaci proteinu hbrm v reakci na poškození DNA způsobené UV zářením nebo jinými činidly. Držení takového mechanismu může způsobit, že buňky budou náchylné k rychlé apoptóze po poškození DNA; buňky myší postrádající Gen hbrm ve skutečnosti podstupují větší stupeň apoptózy po UV záření (17). Kromě toho bylo prokázáno, že proteinový komplex obsahující hbrm je součástí represorového komplexu, který inhibuje transkripci genů pro cykliny E A A, čímž indukuje zastavení růstu ve fázi G1 buněčného cyklu (9). V myeloidních kmenových buňkách nebo leukemických buňkách může inaktivace hbrm ovlivnit aktivitu tohoto represorového komplexu, čímž zabrání zastavení růstu v reakci na poškození DNA. To by zase mohlo zajistit, že buňky obsahující poškození DNA podstoupí apoptózu spíše než zastavení růstu.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.