Kristallstruktur der Caspase-Rekrutierungsdomäne (CARD) des Apoptose-Repressors mit CARD (ARC) und ihre Implikation bei der Hemmung der Apoptose

Kristallstruktur der ARC-KARTE

ARC hemmt sowohl die intrinsischen als auch die extrinsischen Apoptose-Wege durch Interaktion mit verschiedenen Apoptose- verwandte Proteine, einschließlich Fas, FADD und Caspase-8 (Abb. 1A). Es ist bekannt, dass die ARC-CARD-Domäne die Scheibenbildung durch direkte Interaktion mit Fas DD, FADD DD und Caspase-8 DEDs stört (Abb. 1A)29.

Die 2,4 Å Kristallstruktur der CARD-Domäne des Lichtbogens (ARC CARD) wurde mit einer Einwellenlängen-Anomaliebeugungsmethode (SAD) gelöst und auf eine Rfree von 17,0% und eine Rfree von 20,0% verfeinert. Die hochauflösende Struktur der ARC-KARTE zeigte, dass sie fünf Helices, H1 bis H5, umfasst, was nicht die typische Falte der DD-Superfamilie ist (Abb. 1B). Interessanterweise wurde die sechste Helix (H6) nicht an der typischen Stelle erkannt, was darauf hindeutet, dass H6 im Kartenbereich von ARC flexibel sein oder stattdessen eine Schleifenstruktur annehmen könnte. In der asymmetrischen Einheit befanden sich zwei Monomere, Kette A und Kette B (Fig. 1C). Das Modell der Kette A wurde von Rest 5 bis Rest 87 und Rest 91 bis Rest 93 gebaut, während das der Kette B von Rest 5 bis Rest 84 gebaut wurde. Mutmaßliches H6 (von Rest 88 bis 93) konnte aufgrund der schlechten Elektronendichtekarte nicht modelliert werden (Abb. 1B). Jedes Monomer war nahezu identisch und überlagerte sich zu einem RMSD von 0.5 Å (ergänzende Fig. 1). Obwohl eine außergewöhnliche Form von H6 der Kartendomäne mit einer NOD1-Kartenstruktur gemeldet wurde, ist dies der erste Bericht, der zeigt, dass H6 in der Kartendomäne nicht existiert. Die Aminosäuresequenz der H6-Region der ARC-KARTE ist im Vergleich zu denen anderer Karten keine typische Helixsequenz (Abb. 1D). Die mutmaßliche H6-Region der ARC-KARTE (PDPAWDWQH) wurde als zufällige Spulenschleife basierend auf dem Sekundärstrukturvorhersageprogramm vorhergesagt, was darauf hinweist, dass H6 in der ARC-KARTE nicht existiert und stattdessen durch eine Schleife ersetzt wurde. Diese atypische Struktur der CARD-Domäne ist der erste Fall, der in der Death-Domain-Superfamilie beobachtet wurde. Die Länge von H3 war kürzer als die anderer Helices, was ein gemeinsames Merkmal der Death Domain-Superfamilie ist. Die N- und C-Termini der ARC-KARTE befinden sich auf derselben Seite des Moleküls. Das Helixbündel von H1 bis H5 wurde durch einen zentralen hydrophoben Kern aus I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 und L77 dicht gepackt (Fig. 1E). Rückstände, die im Kern vergraben sind und den hydrophoben Cluster von ARC CARD bilden, sind nicht gut konserviert, aber unter verschiedenen Karten am häufigsten, was darauf hindeutet, dass ARC CARD eines der kompaktesten und stabilsten Proteine in der Todesdomänen-Superfamilie sein könnte (Abb. 1D). Das sehr kompakte und geordnete Merkmal der ARC-KARTE zeigt sich am niedrigen durchschnittlichen B-Faktor von 57,9 Å2 (Tabelle 1).

Tabelle 1 Datenerhebungs- und Verfeinerungsstatistiken

Die strukturelle Starrheit des Kernteils der ARC-KARTE und die vorläufig ungeordnete H6-Region der ARC-KARTE sind unterschiedliche Merkmale, die für die Funktionen von ARC kritisch sein können, die durch verschiedene interagierende Proteine einschließlich des TNF-Rezeptors, FADD, BAD und BAX vermittelt werden. ARC CARD ist das einzige Mitglied der Todesdomänen-Superfamilie, das mit verschiedenen Unterfamilien innerhalb der Superfamilie sowie mit Proteinen der Bcl-2-Familie interagieren kann. Die Beziehung zwischen der Fähigkeit des Lichtbogens, verschiedene Bindungspartner aufzunehmen, und ungeordnetem H6 mit einem starren Kern der ARC-KARTE sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.

Dimerschnittstelle innerhalb der ARC-KARTE

Größenausschlusschromatographie und Multiwinkellichtstreuung (MALS) zeigten, dass sich die isolierte ARC-KARTE wie ein Dimer in Lösung verhält (Abb. 2A). Das berechnete monomere Molekulargewicht der ARC-KARTE einschließlich des C-terminalen His-Tags betrug 11,763 Da und das berechnete Molekulargewicht aus MALS betrug 21,901 Da (0,9% Anpassungsfehler) bei einer Polydispersität von 1,000 (Fig. 2A). Es wurde vorgeschlagen, dass ARC über die CARD ein Homo-Dimer bilden kann und dass die CARD-vermittelte Dimerisierung von ARC sein anti-apoptotisches Potenzial aufhebt29. Unsere Kristallstruktur unterstützt auch die dimere Form der ARC-Karte in Lösung. Die Dimerisierung der Todesdomänen-Superfamilie einschließlich CARD ist nicht überraschend, da viele Studien gezeigt haben, dass die DD-Superfamilie in Lösung homodimerisiert werden kann24,33,34. Die homo-dimere Struktur der ARC-KARTE bietet interessante Einblicke in die homo-dimeren Grenzflächen. Die beiden ARC-Karten in der asymmetrischen Einheit sind als asymmetrisches Dimer mit einer Grenzfläche gepackt, die hauptsächlich aus einer elektrostatischen Wechselwirkung besteht (Abb. 2B). Die gesamte Dimeroberfläche vergräbt 916 Å2 (eine Monomeroberfläche von 458 Å2), was 9% der Dimeroberfläche entspricht. Die hauptsächlichen Wechselwirkungskräfte sind Salzbrücken und Wasserstoffbrückenbindungen, die von D13 (an H1), R56 (an H4), R59 (an H4) und R60 (H4) aus Kette A und von D32 (an H2), R37 (an H2), E46 (an H3) und D49 (an H3) aus Kette B (Abb. 2B). Im peripheren Bereich bilden D13 an H1 und R60 an H4 der Kette A Salzbrücken mit R37 an H2 bzw. E46 an H3 der Kette B. Im zentralen Bereich der Grenzfläche bilden R56 und R59 an H4 der Kette A Salzbrücken mit D49 an H3 der Kette B. R59 der Kette A trägt auch zur Bildung einer Salzbrücke mit D32 an H2 der Kette B bei. Der Interaktionsmodus des ARC-Homo-Dimers ähnelt dem des hetero-dimeren Komplexes zwischen Caspase-9-KARTE und APAF-1-KARTE, indem H1 und H4 eines Kartenmoleküls mit H2 und H3 des anderen Kartenmoleküls interagieren, hauptsächlich über Ladungswechselwirkungen35. Diese Art der Interaktion gehört zur Interaktion vom Typ I unter den drei Arten von Interaktionen, die in der Todesdomänen-Superfamilie nachgewiesen wurden14,25. Obwohl über eine einzigartige disulfidbindungsvermittelte homo-dimere Struktur der Kartendomäne einschließlich NOD1 und CARMA1 berichtet wurde33,34, wurde die aktuelle Struktur der ARC-KARTE über eine Typ-I-Schnittstelle dimerisiert, was eine neuartige Methode für die homo-dimere Kartenstruktur darstellt.

Abbildung 2

Dimere Schnittstelle der Struktur der ARC-Karte.

A. MALS-Profil (Multi-Angle Light Scattering). Die rote Linie zeigt das experimentelle Molekulargewicht an. B. Nahaufnahme der wechselwirkenden Reste in der Grenzfläche zwischen zwei Monomeren. Helices sind beschriftet und Reste, die am Kontakt beteiligt sind, sind als Sticks dargestellt. Salzbrücken sind als gestrichelte Linien dargestellt.

Um die neuartige homo-dimere Struktur von Lichtbogenfasern zu analysieren, die durch große elektrostatische Wechselwirkungen gebildet werden, führten wir Größenausschlusschromatographie- und MALS-Experimente in Gegenwart von hohem Salzgehalt (1,5 M NaCl) und niedrigem pH-Wert (pH 3) durch, was dazu führte, dass die Carboxylate protoniert und die geladenen Wechselwirkungen gestört wurden. Wie erwartet wurde ARC CARD bei hohen Salz- und niedrigen pH-Bedingungen zu einem Monomer (Abb. 3A und ergänzend Fig. 2A und 2B). Da D49, R56 und R59 als kritische Rückstände für die Bildung dieser neuartigen Grenzfläche identifiziert werden, führten wir auch eine Mutagenesestudie durch, um die Grenzfläche zu analysieren. Jeder Rückstand (D49, R56 und R59) wurde zu entgegengesetzten Ladungen mutiert und für die Größenausschlusschromatographie- und MALS-Experimente verwendet. Wie in Fig. 3B wurde der bei der Größenausschlusschromatographie beobachtete Elutionspeak des Wildtyps durch Mutation an eine monomere Stelle verschoben. Die durch MALS und erwartete Stöchiometrie unter verschiedenen Bedingungen bestimmten Molekulargewichte sind in Fig. 3C. Die Rohdaten für MALS sind auch in ergänzender Abb. 2. Die Größenausschlusschromatographie und das MALS-Experiment zeigten, dass die dimere ARC-KARTE über Mutationen des Grenzflächenrestes D49R, R56E und R59E und Doppelmutanten zu einem Monomer wurde (Abb. 3B und 3C und ergänzend Fig. 2). Veränderungen der Oligomerisierung als Reaktion auf Mutationen wurden durch Native-PAGE bestätigt. Die Abwärtsverschiebung der Bande durch Mutationen zeigt an, dass die dimere ARC-KARTE als Reaktion auf Mutationen in Lösung monomer wurde (Abb. DREIDIMENSIONAL). Die Erzeugung einer Abstrich-Up-Shifting-Bande durch D49R-Mutation war eine unerwartete Ausnahme, von der wir glauben, dass sie als Reaktion auf durch Mutagenese induzierte Ladungsänderungen auftrat. Da verschobene oder neu produzierte Banden auf Native-PAGE gute Indikatoren für die Störung oder Bildung des Proteinkomplexes sind, kann die durch D49R erzeugte Bande immer noch eine Monomerbande sein. Eine andere Möglichkeit ist, dass D49R während der Konzentration ein Dimer bildet. Bei hoher Konzentration wurde die schwach gestörte Mutante D49R zu einem Dimer in Lösung. Da die Doppelmutante D49R, R59E, eine monomere Bande erzeugte (Abb. 3D) ist D49R möglicherweise nicht ausreichend, um geladene Wechselwirkungen zu stören. Um zu bestätigen, dass die Dimerunterbrechung durch Mutationen nicht auf unerwartete strukturelle Veränderungen durch Mutagenese zurückzuführen ist, sondern auf spezifische Mutationen, die die dimere Grenzfläche stören können, haben wir die far UV Circular Dichroic (CD) -Spektren ausgewertet (Ergänzende Abb. S3). Die CD-Spektren zeigten typische α-helikale Proteine mit zwei ausgeprägten Minima bei 208 nm und 222 nm und einem Maxima bei 195 nm, das dem des Wildtyps ähnlich ist und mit der Molekülstruktur anderer Mitglieder der DD-Superfamilie well36 übereinstimmt. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die Störung der ARC-CARD-Dimerisierung wie erwartet durch spezifische Mutagenese verursacht wird, nicht jedoch durch die unerwarteten strukturellen Veränderungen, die durch Mutagenese entstehen.

Abbildung 3

Analyse der Schnittstelle gebildet durch Homo-Dimer der ARC-Karte.

A. Größenausschlusschromatographieprofil bei hohem Salzgehalt und niedrigem pH-Wert. B. Größenausschlusschromatographieprofil verschiedener Mutationen. C. Hohes Salz, niedriger pH-Wert und Mutationseffekte auf die Dimerbildung. Das gemessene Molekulargewicht und die erwartete Stöchiometrie sind angegeben. D. Native-SEITE. Wt steht für Wild type.

Zusammengenommen bildet ARC CARD erwartungsgemäß Homo-Dimer in Lösung, was in einem früheren In-vivo-experiment29 gezeigt wurde, und diese Dimerisierung wird durch Typ-I-Wechselwirkung mit hochgeladenen Wechselwirkungen vermittelt, die in anderen Überfamilieninteraktionen mit Todesdomänen und heterodimeren Kartendomänen-Wechselwirkungen nachgewiesen wurden. Da diese Homo-Dimerisierung der ARC-KARTE den Verlust der inhibitorischen Aktivität von ARC verursachte, ist es möglich, dass ARC-KARTE diese homo-dimere Schnittstelle verwendet, um mit anderen Proteinen zu interagieren. Die Aufdeckung der Proteininteraktionsschnittstelle, die in unserer aktuellen Studie nachgewiesen wurde, ist für die Bestimmung der Funktion von ARC unerlässlich.

Vergleich mit anderen Kartenstrukturen

Eine strukturelle Homologiesuche mit DALI37 zeigte, dass ARC CARD anderen Karten sehr ähnlich ist. Die acht besten Spiele mit Z-Scores von 13,8 bis 7,7 waren NOD1, BinCARD, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 und RAIDD (Tabelle 2). Die Überlagerung aller neun Karten zeigte, dass die Strukturen aller Karten durch H1 bis H5 gut überlagert sind, mit Ausnahme von H6, das in der Struktur der KARTE nicht einmal erkannt wurde (Abb. 4A). H6 der NOD1-KARTE ist mit H5 verbunden und nicht geknickt. H6 der meisten Karten ist dicht im zentralen Bündel gepackt, während H6 der NLRP1-KARTE weit vom zentralen Bündel entfernt ist (Abb. 4A).

Tabelle 2 Strukturelle Ähnlichkeitssuche mit DALI

Paarweise strukturelle Ausrichtungen zwischen ARC-KARTE und diesen anderen Karten zeigten deutliche strukturelle Unterschiede und Ähnlichkeiten (Abb. 4B-G). Die KARTE, die am besten mit ARC-KARTE überlagert wurde, war NOD1. Der Besitz von atypischem H6 war ein interessantes Merkmal der ARC-KARTE und der NOD1-KARTE (Abb. 4B), während H1 der ARC-KARTE länger war als die anderer Karten. Basierend auf den Fragmentresten der ARC-KARTE ähnelt die Position von vorläufigem H6 der Position von H6 von NLRP1 (Abb. 4D). Die auffälligen Unterschiede in H6 zeigen die dynamische Natur von H6 zwischen verschiedenen Karten. Das gebogene H1, das in allen Kartenstrukturen, einschließlich der aktuellen ARC-KARTE, erkannt wurde, ist auch ein interessantes Merkmal, das nur an der Struktur von Karten erkannt wurde.

ARC KARTE hat ähnliche grobe eigenschaften in seine elektro oberfläche als andere Karten. Ähnlich wie bei den meisten anderen Karten besteht beispielsweise auch die ARC-Kartenoberfläche aus einer Mischung positiv und negativ geladener Merkmale. Die geladenen Cluster befinden sich in der Grenzfläche des homo-dimeren Komplexes. Da es sich bei Karten um Protein-Interaktionsmodule handelt, bestimmen ihre Oberflächenmerkmale die Art der Interaktion mit Partnern. Basierend auf der Analyse der elektrostatischen Oberfläche der ARC-KARTE könnte es möglich sein, diese geladene Wechselwirkung für die homo- oder heterodimere Komplexbildung zu verwenden.

Konservierte Oberfläche der ARC-KARTE: potentielle Interaktionsstelle mit Fas DD und FADD DD zur Hemmung der Scheibenanordnung

Eine Anzahl von Rückständen auf der Oberfläche der ARC-KARTE, die als kritisch für die Bildung der Grenzfläche des homo-dimeren Komplexes identifiziert wurden, sind an Fas (DD), FADD (DED) und Caspase-8 (der erste DED) konserviert, die bekannte Bindungspartner von ARC sind (Abb. 5A). Dazu gehören D32, R37, D49, R56, R59 und R60 (Abb. 2B und 5A). D32 ist sowohl bei Fas DD als auch bei FADD DD konserviert, während D49 bei FADD DD und Caspase-8 DED1 konserviert ist und R60 bei Fas DD und Caspase-8 DED1 konserviert ist. R37 und R59 sind nur bei FADD DD konserviert, während R56 nur bei Caspase-801 konserviert ist. D13 und E46, die kritische Reste für die Bildung des homo-dimeren Komplexes von ARC CARD sind, sind überhaupt nicht konserviert (Abb. 5A).

Abbildung 5

Modell der molekularen Basis der Hemmung der Scheibenbildung durch ARC-KARTE.

A. Sequenzausrichtung der ARC-KARTE mit ihren Bindungspartnern Fas DD, FADD DD und Caspase-8 DED. Rückstände, die für die homo-dimere Wechselwirkung von ARC CARD kritisch sind, waren blau für eine Seite der Oberfläche und rot für die andere Seite. Konservierte Reste auf Fas DD, FADD DD und Caspase-8 DED sind ebenfalls rot oder blau dargestellt. B. Die obere Tafel zeigt ein schematisches Diagramm der drei Arten von Wechselwirkungen in den Todesdomänen-Superfamilienkomplexen. DDS: Todesdomäne Superfamilie. Die untere Platte zeigt die Struktur der Caspase-9-Karte (Casp-9) / APAF-1-Komplex, eine repräsentative KARTE: Karteninteraktion durch Typ-I-Interaktion gebildet. C. Modell der Interaktion zwischen ARC-Karte und Fas DD. Reste, die an der Wechselwirkung beteiligt sein könnten, werden als Stäbchen dargestellt. D. Modell der Interaktion zwischen ARC-Karte und FADD DD. Reste, die an der Wechselwirkung beteiligt sein könnten, werden als Stäbchen dargestellt.

Drei Arten von Interaktionen (Typen I, II und III) an sechs einzigartigen Grenzflächen (Typen Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa und IIIb) wurden in den Interaktionen mit der Death Domain Superfamilie identifiziert (Abb. 5B)14,38. Die typische heterodimere Wechselwirkung mit der CARD-Domäne wurde durch die Kristallstruktur des Caspase-9-CARD- und APAF-1-CARD-Komplexes identifiziert und die Wechselwirkung wurde durch die Typ-I-Interaktionen gebildet35. Die Oberfläche des Typs Ia wird hauptsächlich durch Reste an den H1- und H4-Helices gebildet und interagiert mit der Oberfläche des Typs Ib, die hauptsächlich durch Reste an den H2- und H3-Helices gebildet wird (Fig. 5B).

Basierend auf der Sequenzausrichtung, der zuvor gelösten Kartenkomplexstruktur und der Position der konservierten Reste, die für die Bildung des homo-dimeren Komplexes der ARC-Karte entscheidend sind, entwickelten wir ein vorläufiges inhibitorisches Modell der ARC-KARTE durch Interaktion mit Fas DD oder FADD DD. Da D13, R56, R59 und R60, die kritische Rückstände für die Bildung einer Seite der homo-dimeren Grenzfläche der ARC-KARTE sind, am Fas DD und FADD DD nicht relativ konserviert sind, wurde diese Seite der ARC-KARTE als vorläufige Interaktionsstelle verwendet. Fas DD oder FADD DD wurde dann der ARC-KARTE auf der anderen Seite überlagert, um eine Typ-I-Interaktion herzustellen. Das ARC: Fas-Komplexmodell zeigte, dass R56, R59 und R60 von ARC CARD eine massive geladene Wechselwirkung mit D261 und E256 von Fas DD bilden (Abb. 5C). D13 der ARC-KARTE könnte auch an der Wechselwirkung beteiligt sein, indem eine Salzbrücke mit K301 von Fas DD gebildet wird. Im Falle des ARC: FADD-Komplexmodells könnten D123 und D127 aus H3 von FADD DD an der Interaktion mit dem Basispatch (gebildet durch R56, R59 und R60) der ARC-KARTE teilgenommen haben (Abb. 5D). Die Grenzflächen der Modellstrukturen waren nach dem Schnittstellenanalyseprogramm PISA strukturell und energetisch günstig39.

Die erste homo-dimere Kartenstruktur von ARC und Follow-up-Studien deuten auf einen ARC-vermittelten molekularen Hemmmechanismus der Bandscheibenanordnung hin, die der kritische Signalmolekülkomplex im extrinsischen Apoptose-Signalweg ist. Da kürzlich über den multimeren CARD-Domain-Komplex von RIG-1 und MAVS berichtet wurde, die alle drei Arten von Interaktionen verwenden, die für die Assemblierung der Death-Domain-Unterfamilie nachgewiesen wurden, kann die Tatsache, dass ARC CARD während des Inhibitionsprozesses einen höheren oligomeren Komplex mit Fas DD oder FADD DD bildet, nicht ignoriert werden. In diesem Fall könnte eine ausgedehnte Oberfläche der KARTE mit Rückständen, die sich durch alle fünf Helices ihrer Struktur ausbreiten, an der Assemblierung des inhibitorischen Komplexes beteiligt gewesen sein. Weitere Anstrengungen zur Lösung der komplexen Struktur sind erforderlich, um einen klareren Einblick in die molekularen Grundlagen der Hemmung durch ARC zu erhalten. Es wurde jedoch berichtet, dass Homo-Dimerisierung von ARC-KARTE verursacht Verlust der inhibitorischen Aktivität von ARC, was darauf hinweist, dass unser vorgeschlagenes Modell der Komplexe mit Fas DD und FADD genau ist. Die Aufdeckung der in der aktuellen Studie nachgewiesenen Proteininteraktionsschnittstelle könnte für die Interaktion mit anderen Bindungspartnern für die ordnungsgemäße inhibitorische Funktion von ARC während der Apoptose und Nekroptose von entscheidender Bedeutung sein.

ARC wird prominent in Herz- und Skelettmuskelzellen exprimiert und verhindert den apoptotischen Zelltod dieser postmitotischen Muskelzellen. Die Beteiligung von ARC an einer Kardiomyopathie unter Stressbedingungen wurde in einem Mausmodell beobachtet40, was darauf hindeutet, dass ARC eng mit Herzerkrankungen beim Menschen verbunden sein könnte. Eine inhibitorische Funktion des neuronalen Zelltods von ARC wurde auch in einer Mausstudie berichtet41, was darauf hindeutet, dass ARC für neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen von entscheidender Bedeutung sein könnte. Eine hohe Expression von ARC wird häufig bei malignen Tumoren beobachtet, was darauf hindeutet, dass es für die Tumorentwicklung und -progression wesentlich sein könnte. In diesem Aspekt könnte ARC ein kritisches Molekül sein, das den apoptotischen und nekrotischen Zelltod kontrollieren kann; Dementsprechend führt das Versagen, die Funktion von ARC zu kontrollieren, zu tödlichen Krankheiten beim Menschen. Daher könnte ARC ein gutes Ziel für therapeutische Interventionen sein, und die in dieser Studie vorgestellte ARC-CARD-Struktur könnte der erste Schritt zum Verständnis der ARC-CARD-vermittelten Proteininteraktionen und ihrer inhibitorischen Kapazität sein. Kleine Moleküle, die die Aktivität von ARC steuern können, indem sie auf die homo- und hetero-oligomere Grenzfläche abzielen, könnten gute Regulatoren des apoptotischen und nekrotischen Zelltods und daher potenzielle Wirkstoffkandidaten sein.

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