Estructura cristalina del dominio de reclutamiento de caspasa (TARJETA) del represor de apoptosis con TARJETA (ARCO) y su implicación en la inhibición de la apoptosis

Estructura cristalina de TARJETA de ARCO

El ARCO inhibe las vías de apoptosis intrínsecas y extrínsecas a través de la interacción con varias proteínas relacionadas con la apoptosis, FADD y caspasa-8 (Fig. 1A). Se sabe que el dominio de la TARJETA ARC interfiere con la formación del DISCO a través de la interacción directa con Fas DD, FADD DD y caspase-8 DEDs (Fig. 1A) 29.

La estructura cristalina de 2,4 Å del dominio de la TARJETA de ARCO (TARJETA de ARCO) se resolvió utilizando un método de difracción anómala de una sola longitud de onda (SAD) y se refinó a un Rwork de 17,0% y un Rfree de 20,0%. La estructura de alta resolución de la tarjeta ARC mostró que comprende cinco hélices, H1 a H5, que no es el pliegue típico de la superfamilia DD (Fig. 1B). Curiosamente, la sexta hélice (H6) no se detectó en la ubicación típica, lo que indica que H6 podría ser flexible en el dominio de la tarjeta de ARCO o adoptar una estructura de bucle en su lugar. Había dos monómeros en la unidad asimétrica, cadena A y cadena B (Fig. 1C). El modelo de la cadena A se construyó a partir del residuo 5 al residuo 87 y del residuo 91 al residuo 93, mientras que el de la cadena B se construyó a partir del residuo 5 al residuo 84. El supuesto H6 (del residuo 88 al 93) no se pudo modelar debido al pobre mapa de densidad electrónica (Fig. 1B). Cada monómero era casi idéntico y se superponía a un RMSD de 0.5 Å (Suplemento Fig. 1). Aunque se informó de una forma extraordinaria de H6 del dominio de la TARJETA con una estructura de TARJETA NOD1, este es el primer informe que muestra que H6 no existe en el dominio de la TARJETA. La secuencia de aminoácidos de la región H6 de la TARJETA de ARCO no es una secuencia de hélice típica en comparación con las de otras tarjetas (Fig. 1D). La supuesta región H6 de la TARJETA de ARCO (PDPAWDWQH) se predijo como un bucle de bobina aleatorio basado en el programa de predicción de estructura secundaria, lo que indica que H6 no existe en la TARJETA de ARCO y en su lugar fue reemplazado por un bucle. Esta estructura atípica del dominio de la TARJETA es el primer caso observado entre la superfamilia del dominio de la muerte. La longitud de H3 era más corta que la de otras hélices, que es una característica común de la superfamilia de dominios de muerte. Los terminales N y C de la TARJETA ARC residen en el mismo lado de la molécula. El haz de hélices de H1 a H5 estaba apretado por un núcleo central hidrofóbico compuesto por I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 y L77 (Fig. 1E). Los residuos enterrados dentro del núcleo que forman el grupo hidrofóbico de la TARJETA de ARCO no están bien conservados, pero son los más abundantes entre las diferentes tarjetas, lo que indica que la TARJETA de ARCO podría ser una de las proteínas más compactas y estables entre la superfamilia del dominio de la muerte (Fig. 1D). La característica altamente compacta y ordenada de la TARJETA ARC se muestra por el factor B medio bajo de 57,9 Å2 (Tabla 1).

Cuadro 1 Estadísticas de reunión y perfeccionamiento de datos

La rigidez estructural de la parte central de la TARJETA de ARCO y la región H6 tentativamente desordenada de la TARJETA de ARCO son características distintas que podrían ser críticas para las funciones del ARCO, que están mediadas por varias proteínas que interactúan, incluidos el receptor TNF, FADD, BAD y BAX. ARC CARD es el único miembro de la superfamilia del dominio de la muerte que puede interactuar con diferentes subfamilias dentro de la superfamilia, así como con proteínas de la familia Bcl-2. La relación entre la capacidad del arco para acomodar a varios socios de unión y H6 desordenado con un núcleo rígido de TARJETA de ARCO debe investigarse en estudios futuros.

La interfaz de dímero dentro de la TARJETA DE ARCO

La cromatografía de exclusión de tamaño y la dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) indicaron que la TARJETA de ARCO aislada se comporta como un dímero en solución (Fig. 2A). El peso molecular monomérico calculado de la TARJETA de ARCO, incluido el His-tag del terminal C, fue de 11,763 Da y el peso molecular calculado a partir de MALS fue de 21,901 Da (error de ajuste del 0,9%), con una polidispersidad de 1,000 (Fig. 2A). Se ha sugerido que el ARCO puede formar un homodímero a través de la TARJETA y que la dimerización mediada por TARJETA del ARCO suprime su potencial antiapoptótico29. Nuestra estructura de cristal también admite la forma dimérica de la TARJETA de ARCO en solución. La dimerización de la superfamilia del dominio de la muerte, incluyendo CARD, no es sorprendente porque muchos estudios han demostrado que la superfamilia DD puede ser homodimerizada en solucione24,33,34. La estructura homodimérica de la tarjeta ARC proporciona una visión interesante de las interfaces homodiméricas. Las dos tarjetas de ARCO en la unidad asimétrica se empaquetan como un dímero asimétrico con una interfaz compuesta principalmente por una interacción electrostática (Fig. 2B). La superficie total del dímero entierra 916 Å2 (una superficie de monómero de 458 Å2), lo que representa el 9% de la superficie del dímero. Las principales fuerzas de interacción son puentes de sal y enlaces de hidrógeno, que son hechos por D13 (en H1), R56 (en H4), R59 (en H4) y R60 (H4) de la cadena A y por D32 (en H2), R37 (en H2), E46 (en H3) y D49 (en H3) de la cadena B (Fig. 2B). En la región periférica, D13 en H1 y R60 en H4 de la cadena A forman puentes salinos con R37 en H2 y E46 en H3 de la cadena B, respectivamente. En la región central de la interfaz, R56 y R59 en H4 de la cadena A forman puentes salinos con D49 en H3 de la cadena B. R59 de la cadena A también contribuye a la formación de un puente salino con D32 en H2 de la cadena B. El modo de interacción del homodímero de ARCO es similar al del complejo heterodímero entre la TARJETA caspasa-9 y la TARJETA APAF-1 en que H1 y H4 de una molécula de TARJETA interactúan con H2 y H3 de la otra molécula de TARJETA, principalmente a través de interacciones carga-carga 35. Este tipo de interacción pertenece a la interacción tipo I entre los tres tipos de interacciones detectadas en el dominio de la muerte superfamilia14,25. Aunque se ha informado de una estructura homodimérica única mediada por enlaces disulfuro del dominio de la TARJETA,incluidos NOD1 y CARMA133, 34, la estructura actual de la TARJETA ARC se dimerizó a través de una interfaz de Tipo I, que es un método novedoso para la estructura de la TARJETA homodimérica.

Gráfico 2

Interfaz dimérica de la estructura de la TARJETA de ARCO.

A. Perfil de dispersión de luz de varios ángulos (MALS). La línea roja indica el peso molecular experimental. B. Vista de cerca de los residuos que interactúan en la interfaz entre dos monómeros. Las hélices se etiquetan y los residuos involucrados en el contacto se muestran como barras. Los puentes salinos se muestran como líneas discontinuas.

Para analizar la nueva estructura homodimérica de la tarjeta de ARCO formada por grandes interacciones electrostáticas, realizamos cromatografía de exclusión de tamaño y experimentos MALS en presencia de alto contenido de sal (NaCl de 1,5 M) y bajo pH (pH 3), lo que resultó en la protonación de los carboxilatos y la interrupción de las interacciones cargadas. Como era de esperar, la TARJETA ARC se convirtió en un monómero en condiciones de alto contenido de sal y bajo pH (Fig. 3A y Suplemento Fig. 2A y 2B). Debido a que D49, R56 y R59 se identifican como residuos críticos para la formación de esta nueva interfaz, también realizamos un estudio de mutagénesis para analizar la interfaz. Cada residuo (D49, R56 y R59) se mutó a cargas opuestas y se utilizó para los experimentos de cromatografía de exclusión de tamaño y MALS. Como se muestra en la Fig. 3B, el pico de elución del tipo salvaje observado en la cromatografía de exclusión de tamaño se trasladó a un lugar monomérico por mutación. Los pesos moleculares determinados por MALS y estequiometría esperada bajo diversas condiciones se resumen en la fig. 3C. Los datos brutos de las MAL también se muestran en la Fig. 2. El experimento de cromatografía de exclusión de tamaño y MALS mostró que la TARJETA DE ARCO dimérico se convirtió en un monómero a través de mutaciones de residuos de interfaz D49R, R56E y R59E y mutantes dobles (Fig. 3B y 3C y Suplemento Fig. 2). Los cambios en la oligomerización en respuesta a las mutaciones fueron confirmados por native-PAGE. El desplazamiento hacia abajo de la banda por mutaciones indica que la TARJETA de ARCO dimérico se volvió monomérica en solución en respuesta a las mutaciones (Fig. 3D). La generación de una banda de desplazamiento ascendente de frotis por mutación D49R fue una excepción inesperada que creemos que ocurrió en respuesta a cambios de carga inducidos por mutagénesis. Debido a que las bandas desplazadas o de nueva producción en la PÁGINA nativa son buenos indicadores de la interrupción o formación del complejo proteico, la banda generada por D49R aún puede ser una banda monomérica. Otra posibilidad es que D49R forme un dímero durante la concentración. A alta concentración, el mutante D49R débilmente alterado se convirtió en un dímero en solución. Dado que el doble mutante, D49R, R59E, generó una banda monomérica (Fig. 3D), D49R podría no ser suficiente para interrumpir las interacciones cargadas. Para confirmar que la alteración de los dímeros por mutaciones no fue el resultado de cambios estructurales inesperados causados por la mutagénesis, sino más bien debido a mutaciones específicas que pueden alterar la interfaz dimérica, evaluamos los espectros dicroicos circulares (CD) de los rayos UV lejanos (Suplemento Fig. S3). Los espectros CD exhibían proteínas α-helicoidales típicas, con dos mínimos pronunciados a 208 nm y 222 nm y un máximo a 195 nm, que es similar al del tipo salvaje y coincide con la estructura molecular de otros miembros de la superfamilia DD well36. Estos resultados confirmaron que la interrupción de la dimerización de la TARJETA DE ARCO es causada por mutagénesis específica, como se esperaba, pero no por los cambios estructurales inesperados formados por la mutagénesis.

Gráfico 3

Análisis de la interfaz formada por homodímero de la TARJETA de ARCO.

A. Perfil cromatográfico de exclusión de tamaño de condición alta en sal y baja en pH. B. Perfil cromatográfico de exclusión de tamaño de varias mutaciones. C. Altos niveles de sal, bajo pH y efectos de mutación en la formación de dímeros. Se muestra el peso molecular medido y la estequiometría esperada. D. PÁGINA NATIVA. Wt indica tipo salvaje.

En conjunto, la TARJETA ARC forma homodímero en solución, como se esperaba, lo que se demostró en un experimento in vivo anterior29 y esta dimerización está mediada por la interacción de tipo I con interacciones altamente cargadas detectadas en otras interacciones de superfamilia de dominios de muerte e interacciones de dominios de TARJETAS hetero-diméricas. Dado que esta homodimerización de la TARJETA de ARCO causó la pérdida de actividad inhibitoria del ARCO, es posible que la TARJETA de ARCO use esta interfaz homodimérica para interactuar con otras proteínas. Revelar la interfaz de interacción de proteínas que se detectó en nuestro estudio actual es esencial para determinar la función de la ARC.

Comparación con otras estructuras de TARJETAS

Una búsqueda de homología estructural con DALI37 mostró que la TARJETA ARC es muy similar a otras tarjetas. Los ocho primeros partidos, que tuvieron puntuaciones Z de 13,8 a 7,7, fueron NOD1, BinCARD, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 y RAIDD (Tabla 2). La superposición de las nueve cartas indicó que las estructuras de todas las cartas están bien superpuestas a través de H1 a H5, excepto H6, que ni siquiera se detectó en la estructura de la TARJETA de ARCO (Fig. 4A). H6 de la TARJETA NOD1 está conectada a H5 y no torcida. H6 de la mayoría de las tarjetas está bien empaquetada en el paquete central, mientras que H6 de la TARJETA NLRP1 se encuentra lejos del paquete central (Fig. 4A).

Tabla 2 Búsqueda de similitud estructural mediante DALI

Las alineaciones estructurales de pares entre la TARJETA DE ARCO y estas otras tarjetas mostraron claras diferencias y similitudes estructurales (Fig. 4B-G). La TARJETA mejor superpuesta con la TARJETA ARC fue NOD1. La posesión de H6 atípico fue una característica interesante de la TARJETA ARC y la TARJETA NOD1 (Fig. 4B), mientras que H1 de la CARTA ARCO era más larga que la de otras cartas. Basado en los residuos de fragmentos de la TARJETA de ARCO, la ubicación de H6 tentativo es similar a la ubicación de H6 de NLRP1 (Fig. 4D). Las notables diferencias en H6 indican la naturaleza dinámica de H6 entre varias cartas. El H1 doblado detectado en todas las estructuras de TARJETAS, incluida la TARJETA ARC actual, también es una característica interesante que solo se detectó en la estructura de las tarjetas.

La TARJETA ARC tiene características brutas similares en su superficie electrostática que otras tarjetas. Por ejemplo, al igual que la naturaleza cargada de la mayoría de las otras tarjetas, la superficie de la tarjeta ARC también se compone de una mezcla de características cargadas positiva y negativamente. Los cúmulos cargados se encuentran en la interfaz del complejo homodimérico. Debido a que las tarjetas son módulos de interacción de proteínas, sus características de superficie dictan su modo de interacción con los socios. Basado en el análisis de la superficie electrostática de la tarjeta de ARCO, podría ser posible usar esta interacción cargada para la formación de complejos homo o hetero diméricos.

Superficie conservada de la TARJETA de ARCO: sitio de interacción potencial con Fas DD y FADD DD para la inhibición del conjunto de DISCO

En Fas (DD), FADD (DED) y caspasa-8 (el primer DED) se conservan varios residuos en la superficie de la TARJETA DE ARCO que se han identificado como críticos para la formación de la interfaz del complejo homodimérico, que son socios de unión conocidos del arco (Fig. 5A). Estos incluyen D32, R37, D49, R56, R59 y R60 (Fig. 2B y 5A). D32 se conserva tanto en Fas DD como en FADD DD, mientras que D49 se conserva en FADD DD y caspase-8 DED1 y R60 se conserva en Fas DD y caspase-8 DED1. R37 y R59 solo se conservan en FADD DD, mientras que R56 solo se conserva en caspase-8 DED1. D13 y E46, que son residuos críticos para la formación del complejo homodimérico de la TARJETA de ARCO, no se conservan en absoluto (Fig. 5A).

Gráfico 5

Modelo de base molecular de inhibición de la formación de DISCOS por TARJETA de ARCO.

A. Alineación de secuencia de la TARJETA de ARCO con sus socios de unión, Fas DD, FADD DD y caspase-8 DED. Los residuos críticos para la interacción homodimérica de la TARJETA de ARCO eran azules para un lado de la superficie y rojos para el otro lado. Los residuos conservados en Fas DD, FADD DD y caspasa-8 DED también se muestran en rojo o azul. B. El panel superior muestra un diagrama esquemático de los tres tipos de interacciones en los complejos de la superfamilia del dominio de la muerte. DDS: superfamilia de dominios de muerte. El panel inferior muestra la estructura del complejo caspase-9 (Casp-9)/APAF-1, una TARJETA representativa:interacción de TARJETA formada por interacción de tipo I. C. Modelo de interacción entre la TARJETA ARC y Fas DD. Los residuos que podrían participar en la interacción se muestran en forma de barras. D. Modelo de interacción entre la TARJETA ARC y FADD DD. Los residuos que podrían participar en la interacción se muestran en forma de barras.

Se han identificado tres tipos de interacciones (tipos I, II y III) en seis interfaces únicas (tipos Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa y IIIb) en las interacciones con la superfamilia de dominios de muerte (Fig. 5B) 14,38. La interacción heterodimérica típica con el dominio de la TARJETA se identificó por la estructura cristalina de la TARJETA caspasa-9 y el complejo de TARJETAS APAF-1 y la interacción se formó por las interacciones de tipo I35. La superficie de tipo Ia está formada principalmente por residuos en las hélices H1 y H4 e interactúa con la superficie de tipo Ib, que está formada principalmente por residuos en las hélices H2 y H3 (Fig. 5B).

Basado en la alineación de secuencias, la estructura del complejo de TARJETAS previamente resuelta y la ubicación de los residuos conservados críticos para la formación del complejo homodimérico de la TARJETA de ARCO, desarrollamos un modelo inhibitorio tentativo de la TARJETA de ARCO interactuando con Fas DD o FADD DD. Debido a que D13, R56, R59 y R60, que son residuos críticos para la formación de un lado de la interfaz homodimérica de la TARJETA de ARCO, no se conservan relativamente en el Fas DD y el FADD DD, este lado de la TARJETA de ARCO se utilizó como un sitio de interacción tentativa. Fas DD o FADD DD se superpuso a la TARJETA ARC ubicada en el otro lado para realizar una interacción de tipo I. El modelo complejo ARC:Fas mostró que R56, R59 y R60 de la TARJETA ARC forman una interacción cargada masiva con D261 y E256 de Fas DD (Fig. 5C). D13 de ARC CARD también podría estar involucrado en la interacción formando un puente salino con K301 de Fas DD. En el caso del modelo complejo ARC: FADD, D123 y D127 de H3 de FADD DD podrían haber participado en la interacción con el parche básico (formado por R56, R59 y R60) de la TARJETA ARC (Fig. 5D). Las interfaces de las estructuras modelo eran estructural y energéticamente favorables según el programa de análisis de interfaces de PISA 39.

La primera estructura de TARJETAS homodiméricas de ARC y los estudios de seguimiento sugieren un mecanismo inhibitorio molecular mediado por arco del ensamblaje del DISCO, que es el complejo molecular de señalización crítico en la vía de señalización de apoptosis extrínseca. Dado que el complejo de dominios de TARJETAS multiméricas de RIG-1 y MAVS, que utilizan los tres tipos de interacciones que se han detectado para el ensamblaje de la subfamilia de dominios de muerte, se informó recientemente, no se puede ignorar el hecho de que la TARJETA ARC forme un complejo oligomérico superior con Fas DD o FADD DD durante el proceso de inhibición. En este caso, una extensa superficie de TARJETA de ARCO con residuos esparcidos a través de las cinco hélices de su estructura podría haber participado en el ensamblaje del complejo inhibitorio. Se necesitan más esfuerzos para resolver la estructura compleja para obtener una visión más clara de la base molecular de la inhibición por arco. Sin embargo, se ha reportado que la homodimerización de la TARJETA de ARCO causó la pérdida de la actividad inhibitoria del ARCO, lo que indica que nuestro modelo propuesto de los complejos con Fas DD y FADD es preciso. Revelar la interfaz de interacción de proteínas detectada en el estudio actual podría ser crítico para la interacción con otros socios de unión para la función inhibitoria adecuada de la ARC durante la apoptosis y la necroptosis.

La ARC se expresa de manera prominente en las células musculares cardíacas y esqueléticas y previene la muerte celular apoptótica de esas células musculares postmitóticas. En un modelo de ratón40 se observó compromiso de la ARC en cardiomiopatía en condiciones de estrés, lo que indica que la ARC podría estar estrechamente relacionada con enfermedades cardíacas en humanos. También se informó de la función inhibitoria de la muerte celular neuronal de la ARC en un estudio en ratones 41, lo que indica que la ARC podría ser crítica para las enfermedades neurodegenerativas en humanos. Con frecuencia se observa una alta expresión de arco en tumores malignos, lo que indica que podría ser esencial para el desarrollo y la progresión del tumor. En este aspecto, el ARC podría ser una molécula crítica que puede controlar la muerte celular apoptótica y necrótica; en consecuencia, la falta de control de la función del ARC conduce a una enfermedad mortal en los seres humanos. Por lo tanto, la ARC podría ser un buen objetivo para la intervención terapéutica y la estructura de la TARJETA DE ARCO presentada en este estudio podría ser el primer paso para comprender las interacciones de proteínas mediadas por la TARJETA de ARCO y su capacidad inhibitoria. Las moléculas pequeñas que pueden controlar la actividad del arco dirigiéndose a la interfaz homo y heteroligomérica podrían ser buenos reguladores de la muerte celular apoptótica y necrótica y, por lo tanto, posibles candidatos a fármacos.

Deja una respuesta

Tu dirección de correo electrónico no será publicada.