apoptoosin repressorin (CARD) kiderakenne ja sen implisiittinen vaikutus apoptoosin estoon

ARC-kortin kiderakenne

ARC estää sekä sisäisen että ulkoisen apoptoosin reitit vuorovaikutuksen kautta erilaisten apoptoosiin liittyvien apoptoosin kanssa proteiineja, kuten FAS, fadd ja kaspaasi-8 (kuva. 1 A). ARC CARD domainin tiedetään häiritsevän levyn muodostumista suoran vuorovaikutuksen kautta Fas DD: n, FADD DD: n ja caspase-8 DEDs: n (Fig. 1 A) 29.

Arc-kortin (ARC CARD) korttialueen 2,4 Å: n kiderakenne ratkaistiin yhden aallonpituuden anomaalidiffraktiomenetelmällä (SAD) ja tarkennettiin 17,0%: n Rworkiksi ja 20,0%: n Rfree: ksi. ARC-kortin korkean resoluution rakenne osoitti, että se koostuu viidestä kierteestä, H1-H5, mikä ei ole tyypillinen DD-superperheen taitos (Kuva. 1b). Mielenkiintoista on, että kuudetta helixiä (H6) ei havaittu tyypillisessä paikassa, mikä osoittaa, että H6 saattaa olla joustava kaaren korttialueella tai ottaa sen sijaan käyttöön silmukkarakenteen. Epäsymmetrisessä yksikössä oli kaksi monomeeriä, ketju A ja ketju B (Kuva. 1C). Ketjun a malli rakennettiin jäämästä 5 jäämään 87 ja jäämästä 91 jäämään 93, kun taas ketjun B malli rakennettiin jäämästä 5 jäämään 84. Oletettavaa H6: ta (jäämistä 88-93) ei voitu mallintaa huonon elektronitiheyskartan vuoksi (kuva. 1b). Jokainen monomeeri oli lähes identtinen ja päällekkäin rmsd: n kanssa 0.5 Å (Täsmennyssivu 1). Vaikka kortin verkkotunnuksen H6: n poikkeuksellisesta muodosta raportoitiin NOD1 – korttirakenne, tämä on ensimmäinen raportti, joka osoittaa, että H6: ta ei ole KORTTIALUEELLA. KAARIKORTIN H6-alueen aminohappojärjestys ei ole tyypillinen helix-sekvenssi verrattuna muiden korttien (Fig. 1D). Arc-kortin (pdpawdwqh) putatiivinen H6-alue ennustettiin satunnaiseksi kelasilmukaksi sekundaarirakenteen ennustusohjelman perusteella, mikä osoittaa, että H6: ta ei ole ARC-kortissa, vaan se korvattiin silmukalla. Tämä epätyypillinen rakenne kortin verkkotunnuksen on ensimmäinen tapaus havaittu keskuudessa death domain superfamily. H3: n pituus oli lyhyempi kuin muilla heliksillä, mikä on yleinen piirre kuolemansyyn superperheessä. KAARIKORTIN n-ja C-termini sijaitsevat molekyylin samalla puolella. Helix-nippu H1: stä H5: een oli tiiviisti pakattu hydrofobiseen ytimeen, jonka muodostivat I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 ja L77 (Kuva. 1 E). Hydrofobisen KAARIKORTIN rykelmän muodostavaan ytimeen haudatut jäämät eivät säily hyvin, mutta ovat runsaimpia eri korttien joukossa, mikä viittaa siihen, että KAARIKORTTI saattaa olla yksi kompakteimmista ja vakaimmista proteiineista kuolemanseudun superperheen keskuudessa (Kuva. 1D). ARC-kortin erittäin kompaktin ja tilatun ominaisuuden osoittaa alhainen keskimääräinen B-kerroin 57,9 Å2 (Taulukko 1).

Taulukko 1 tiedonkeruu-ja tarkennustilastot

rakenteellinen jäykkyys ydinosan ARC CARD ja alustavasti häiriintynyt H6 alue ARC CARD ovat erillisiä ominaisuuksia, jotka voivat olla kriittisiä toimintoja ARC, jotka välittyvät eri vuorovaikutuksessa proteiineja kuten TNF reseptori, FADD, BAD ja BAX. ARC CARD on ainoa death domain-superperheen jäsen, joka voi olla vuorovaikutuksessa superperheen eri alaheimojen kanssa sekä BCL-2-perheen proteiinien kanssa. Tulevissa tutkimuksissa olisi tutkittava ARC: n kapasiteetin suhdetta erilaisiin sitoviin kumppaneihin ja epäjärjestykseen H6: een, jossa on ARC-kortin jäykkä ydin.

DIMEERILIITTYMÄ KAARIKORTISSA

Kokoerotuskromatografia ja monikulmainen valonsironta (MALS) osoittivat, että eristetty KAARIKORTTI käyttäytyy dimeerinä liuoksessa (Fig. 2 A). ARC-kortin laskettu monomeerinen molekyylipaino sisältäen C-terminaalin His-tagin oli 11.763 Da ja laskettu molekyylipaino MALSISTA oli 21.901 Da (0.9% sovitusvirhe), jonka Polydispersiteetti on 1.000 (Kuva. 2 A). On esitetty, että ARC voi muodostaa homodimeerin kortin kautta ja että ARC: n KORTTIVÄLITTEINEN dimerisaatio poistaa sen apoptoottisen potentiaalin 29. Kiderakenteemme tukee myös kaarikortin dimeeristä muotoa ratkaisussa. Kuoleman verkkotunnuksen superperheen DIMERISOITUMINEN mukaan lukien kortti ei ole yllättävää,sillä monet tutkimukset ovat osoittaneet,että DD-superperhe voi olla homo-dimerisoitunut solution24, 33, 34. KAARIKORTIN homo-dimeerinen rakenne antaa mielenkiintoisen käsityksen homo-dimeerisistä rajapinnoista. Epäsymmetrisen yksikön kaksi KAARIKORTTIA pakataan epäsymmetriseksi dimeeriksi, jonka rajapinta koostuu pääasiassa sähköstaattisesta vuorovaikutuksesta (Fig. 2b). Dimeerin kokonaispinta-ala on 916 Å2 (monomeerin pinta-ala 458 Å2), mikä on 9% dimeerin pinta-alasta. Tärkeimmät vuorovaikutusvoimat ovat suolasillat ja vetysidokset, joita syntyy ketjusta D13 (on H1), R56 (on H4), R59 (on h4) ja R60 (H4) ja ketjusta D32 (on H2), R37 (on H2), E46 (on H3) ja D49 (on H3) ketjusta B (Fig. 2b). Reuna-alueella A-ketjun D13 H1: llä ja R60 H4: llä muodostavat suolasiltoja, joissa vastaavasti on R37 H2: lla ja E46 B-ketjun H3: lla. Rajapinnan keskialueella R56 ja R59 on h4 ketjun a muodossa suolasiltojen kanssa D49 H3 ketjun B. R59 ketjun a edistää myös muodostumista suolasillan kanssa D32 H2 ketjun B. ARC homo-dimeerin vuorovaikutustila on samankaltainen caspase-9-kortin ja APAF-1-kortin välisen heterodimeerisen kompleksin kanssa siinä, että yhden KORTTIMOLEKYYLIN H1 ja H4 vuorovaikuttavat toisen KORTTIMOLEKYYLIN H2: n ja H3: n kanssa ensisijaisesti lataus-lataus interaktioiden 35 kautta. Tämän tyyppinen vuorovaikutus kuuluu tyypin I vuorovaikutukseen kolmen kuolemakohteessa superfamily14,25 havaitun vuorovaikutustyypin joukossa. Vaikka kortin verkkotunnuksen ainutlaatuinen disulfidivälitteinen homo-dimeerinen rakenne, mukaan lukien NOD1 ja CARMA1,on raportoitu 33, 34, ARC-kortin nykyinen rakenne dimerisoitiin tyypin I käyttöliittymällä, joka on uusi menetelmä homo-dimeeriselle kortin rakenteelle.

kuva 2

ARC-kortin rakenteen Dimeerinen liitäntä.

A. Multi-angle light scattering (MALS) profile. Punainen viiva osoittaa kokeellisen molekyylipainon. B. Lähikuva kahden monomeerin rajapinnassa olevista vuorovaikutusjäännöksistä. Kierteet merkitään ja kosketuksessa mukana olevat jäämät näytetään tikkuina. Suolasillat näkyvät katkoviivoina.

analysoidaksemme suurten sähköstaattisten vuorovaikutusten muodostaman ARC-kortin uuden homo-dimeerisen rakenteen teimme koon poissulkukromatografiaa ja MALS-kokeita korkean suolan (1,5 M NaCl) ja alhaisen pH: n (pH 3) läsnä ollessa, mikä johti karboksylaattien protonoitumiseen ja varattujen vuorovaikutusten häiriintymiseen. Odotetusti KAARIKORTISTA tuli monomeeri korkean suolan ja alhaisen pH: n olosuhteissa (Kuva. 3A ja Lisäviikuna. 2A ja 2B). Koska D49, R56 ja R59 tunnistetaan kriittisiksi jäämiksi tämän uuden rajapinnan muodostumiselle, suoritimme myös mutageenitutkimuksen rajapinnan analysoimiseksi. Jokainen jäännös (D49, R56 ja R59) mutatoitiin vastakkaisiin varauksiin, ja sitä käytettiin koon poissulkukromatografia-ja MALS-kokeissa. Kuten kuvassa. 3B, villin tyypin eluutiopiikki, joka havaittiin kokoluokan poissulkukromatografiassa, siirrettiin mutaatiolla monomeeriseen paikkaan. Mals: n määrittämät molekyylipainot ja odotettu Stoikiometria eri olosuhteissa on tiivistetty kuvioon. 3C. Raakatiedot MALS on myös esitetty täydentävässä Kuvassa. 2. Koon poissulkukromatografia-ja MALS-koe osoitti, että dimeerisestä KAARIKORTISTA tuli monomeeri rajapintajäännösten D49R, R56E ja R59E sekä kaksoismutanttien (Fig. 3B ja 3C sekä Lisäviikuna. 2). Mutaatioiden aiheuttamat oligomerisaation muutokset vahvistettiin native-Pagen avulla. Mutaatioiden aiheuttama kaistan siirtyminen alaspäin osoittaa, että dimeerinen KAARIKORTTI muuttui liuoksessa monomeeriseksi mutaatioiden seurauksena (Fig. 3D). D49r-mutaation smear-siirtymäkaistan generointi oli odottamaton poikkeus, jonka uskomme tapahtuneen mutageneesin aiheuttamien varausmuutosten seurauksena. Koska natiivisivulla olevat siirretyt tai vastatuotetut kaistat ovat hyviä indikaattoreita proteiinikompleksin hajoamisesta tai muodostumisesta, d49r: n tuottama kaista voi silti olla monomeerinen kaista. Toinen mahdollisuus on, että d49r muodostaa dimeerin konsentraation aikana. Korkealla pitoisuudella heikosti häiriintynyt mutantti D49R muuttui liuoksessa dimeeriksi. Kaksoismutantista lähtien D49R, R59E, loi monomeerisen kaistan (Kuva. 3D), D49R ei välttämättä riitä häiritsemään varattuja vuorovaikutuksia. Vahvistaaksemme, että mutaatioiden aiheuttamat dimeerihäiriöt eivät johtuneet mutageneesin aiheuttamista odottamattomista rakenteellisista muutoksista, vaan pikemminkin tietyistä mutaatioista, jotka voivat häiritä dimeeristä rajapintaa, arvioimme pitkälle UV-ympyränmuotoisen dikroisen (CD) spektrin (Supplemental Fig. S3). CD-spektrissä esiintyi tyypillisiä α-kierteisiä proteiineja, joissa oli kaksi selvää minimiä 208 nm: ssä ja 222 nm: ssä ja maksimi 195 nm: ssä, mikä on samanlainen kuin villillä tyypillä ja vastasi DD-superperheen muiden jäsenten molekyylirakennetta 36. Nämä tulokset vahvistivat, että KAARIKORTIN dimerisaation häiriintyminen johtuu odotetusti spesifisestä mutageneesistä, mutta ei mutageneesin muodostamista odottamattomista rakenteellisista muutoksista.

kuva 3

ARC-kortin homo-dimerin muodostaman rajapinnan analyysi.

A. poissulkukromatografiaprofiili, jossa korkea suola ja alhainen pH-arvo. B. koko poissulkukromatografiaprofiili eri mutaatioista. C. korkea suola, alhainen pH ja mutaation vaikutukset dimeerien muodostumiseen. On esitetty mitattu molekyylipaino ja odotettu Stoikiometria. D. Natiivisivu. Wt ilmaisee villin tyypin.

yhdessä ARC-kortti muodostaa odotetusti homo-dimerin liuoksessa, joka osoitettiin aiemmassa in vivo-kokeessa29 ja tämä dimerisaatio välittyy tyypin I vuorovaikutuksesta erittäin varautuneiden interaktioiden kanssa, jotka on havaittu muissa death domainin superperheiden interaktioissa ja heterodimeerisissä kortin domainin interaktioissa. Koska tämä ARC-kortin homo-dimerisaatio aiheutti ARC: n inhibitorisen aktiivisuuden menetyksen, on mahdollista, että ARC-kortti käyttää tätä homo-dimeeristä rajapintaa vuorovaikutuksessa muiden proteiinien kanssa. Nykyisessä tutkimuksessamme havaitun proteiinin vuorovaikutusrajapinnan paljastaminen on olennaista ARC: n funktion määrittämisessä.

vertailu muihin KORTTIRAKENTEISIIN

rakenteellinen homologinen haku dali37: llä osoitti, että ARC-kortti on hyvin samanlainen kuin muut kortit. Kahdeksan parasta ottelua, joiden Z-pisteet olivat 13,8-7,7, olivat NOD1, BinCARD, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 ja RAIDD (Taulukko 2). Kaikkien yhdeksän kortin päällekkäisyys osoitti, että kaikkien korttien rakenteet ovat hyvin päällekkäin H1: stä H5: een, paitsi H6: ssa, jota ei edes havaittu ARC-kortin rakenteessa (Kuva. 4 A). NOD1-kortin H6 on kytketty H5: een eikä sitä ole kytketty. Useimpien korttien H6 on tiiviisti pakattuna keskuskimpussa, kun taas NLRP1-kortin H6 sijaitsee kaukana keskuskimpusta (Kuva. 4 A).

Taulukko 2 rakenteellinen samankaltaisuus haku käyttäen DALI

pareittain rakenteelliset linjaukset ARC-kortin ja näiden muiden korttien välillä osoittivat selviä rakenteellisia eroja ja yhtäläisyyksiä (Kuva. 4B-G). Arc-kortilla parhaiten pärjännyt kortti oli NOD1. Epätyypillisen H6: n hallussapito oli mielenkiintoinen piirre ARC-kortissa ja NOD1-kortissa (Kuva. 4B), kun taas ARC-kortin H1 oli pidempi kuin muiden korttien. ARC-kortin fragmenttijäämien perusteella alustavan H6: n sijainti on samanlainen kuin nlrp1: n H6: n sijainti (Kuva. 4D). H6: n huomattavat erot kertovat H6: n dynaamisesta luonteesta eri korttien välillä. Kaikissa KORTTIRAKENTEISSA, mukaan lukien nykyinen KAARIKORTTI, havaittu taivutettu H1 on myös mielenkiintoinen ominaisuus, joka havaittiin vain korttien rakenteessa.

KAARIKORTILLA on sähköstaattiselta pinnaltaan samanlaiset brutto-ominaisuudet kuin muillakin korteilla. Esimerkiksi, kuten useimpien muiden korttien lataus, ARC-kortin pinta koostuu myös positiivisesti ja negatiivisesti varautuneiden ominaisuuksien sekoituksesta. Varautuneet klusterit sijaitsevat homodimeerisen kompleksin rajapinnassa. Koska kortit ovat proteiinin vuorovaikutusmoduuleja, niiden pintaominaisuudet sanelevat niiden vuorovaikutustavan kumppaneiden kanssa. ARC-kortin sähköstaattisen pinnan analyysin perusteella voisi olla mahdollista käyttää tätä varattua vuorovaikutusta homo – tai heterodimeerisessä kompleksimuodostuksessa.

KAARIKORTIN säilötty pinta: mahdollinen interaktiopaikka FAS DD: n ja FADD DD: n kanssa levykokoonpanon eston osalta

useita jäämiä ARC-kortin pinnalla, joiden on todettu olevan kriittisiä homo-dimeerisen kompleksin rajapinnan muodostumiselle, säilytetään FAS: llä (DD), fadd: llä (ded) ja caspase-8: lla (ensimmäinen ded), jotka ovat tunnettuja ARC: n sitovia kumppaneita (Fig. 5 A). Näitä ovat D32, R37, D49, R56, R59 ja R60 (Kuva. 2B ja 5A). D32: ta säilytetään sekä Fas DD: ssä että fadd DD: ssä, kun taas D49: ää säilytetään fadd DD: ssä ja caspase-8 DED1: ssä ja R60: tä säilytetään FAS DD: ssä ja caspase-8 ded1: ssä. R37 ja R59 säilyvät vain fadd DD: ssä, kun taas R56 säilyy vain caspase-8 DED1: ssä. D13 ja E46, jotka ovat kriittisiä jäämiä KAARIKORTIN homo-dimeerisen kompleksin muodostumiselle, eivät säily lainkaan (Kuva. 5 A).

kuva 5

Model of molecular basis of inhibition of DISC formation by ARC CARD.

A. Arc-kortin sekvenssin yhdenmukaistaminen sitovien kumppaniensa, Fas DD: n, FADD DD: n ja caspase-8 DED: n kanssa. ARC-kortin homo-dimeeriselle vuorovaikutukselle kriittiset jäämät olivat pinnan toisella puolella sinistä ja toisella puolella punaista. Säilyneet jäämät Fas DD: llä, fadd DD: llä ja caspase-8 DED: llä esitetään myös punaisina tai sinisinä. B. yläpaneeli näyttää kaaviokuvan kuoleman domainin superperhoskompleksien kolmesta vuorovaikutustyypistä. DDS: death domain superfamily. Alapaneelissa näkyy caspase-9-kortin (Casp-9)/APAF-1-kompleksin rakenne, joka on edustava kortti:tyypin I vuorovaikutuksen muodostama KORTTIVÄLI. C. Arc-kortin ja Fas DD: n välisen vuorovaikutuksen malli. Yhteisvaikutukseen mahdollisesti osallistuvat jäämät esitetään tikkuina. D. Arc-kortin ja FADD DD: n välisen vuorovaikutuksen malli. Yhteisvaikutukseen mahdollisesti osallistuvat jäämät esitetään tikkuina.

kolmentyyppisiä yhteisvaikutuksia (tyypit I, II ja III) kuudessa ainutlaatuisessa rajapinnassa (tyypit Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa ja IIIb) on tunnistettu yhteisvaikutuksissa kuolemien superperheen kanssa (kuva. 5B) 14,38. Tyypillinen heterodimeerinen vuorovaikutus kortin domeenin kanssa tunnistettiin kaspase-9-kortin ja APAF-1-KORTTIKOMPLEKSIN kiderakenteesta ja vuorovaikutus muodostui tyypin I interactions35. Tyypin Ia pinta muodostuu pääasiassa H1-ja H4-kierteissä olevista jäämistä ja vuorovaikuttaa tyypin Ib pinnan kanssa, joka muodostuu pääasiassa H2-ja H3-kierteissä olevista jäämistä (Kuva. 5b).

sekvenssin linjauksen, aiemmin ratkaistun KORTTIKOMPLEKSIN rakenteen ja KAARIKORTIN homo-dimeerisen kompleksin muodostumisen kannalta kriittisten säilyneiden jäämien sijainnin perusteella kehitimme Arc-kortin alustavan estomallin vuorovaikutuksessa Fas DD: n tai FADD DD: n kanssa. Koska D13, R56, R59 ja R60, jotka ovat kriittisiä jäämiä ARC-kortin homo-dimeerisen rajapinnan toisen puolen muodostumiselle, eivät ole suhteellisen säilyneet Fas DD: ssä ja FADD DD: ssä, ARC-kortin tätä puolta käytettiin alustavana vuorovaikutuspaikkana. Fas DD tai FADD DD oli sitten päällekkäin ARC-kortti sijaitsee toisella puolella tehdä tyypin I vuorovaikutus. ARC: Fas-kompleksimalli osoitti, että ARC-kortin R56, R59 ja R60 muodostavat massiivisen ladattavan vuorovaikutuksen Fas DD: n D261: n ja E256: n kanssa (kuva. 5c). ARC-kortin D13 saattaa myös osallistua vuorovaikutukseen muodostamalla suolasillan Fas DD: n K301: n kanssa. Tapauksessa ARC: fadd monimutkainen malli, D123 ja D127 alkaen H3 fadd DD on saattanut osallistua vuorovaikutukseen perus laastari (muodostuu R56, R59 ja R60) ARC-kortin (kuva. 5D). Mallirakenteiden rajapinnat olivat rakenteellisesti ja energeettisesti suotuisat PISA interface analysis program39-ohjelman mukaan.

ARC – ja seurantatutkimusten ensimmäiset homo-dimeeriset KORTTIRAKENTEET viittaavat KIEKKOKOKOONPANON KAARIVÄLITTEISEEN molekyylinestomekanismiin, joka on kriittinen merkinantomolekyylikompleksi ulkopuolisessa apoptoosin merkinantoreitissä. Koska rig-1: n ja MAVS: n multimeric CARD domain complex, jossa käytetään kaikkia kolmea Death domain-alaperheen kokoonpanoon havaittua vuorovaikutusta, raportoitiin äskettäin, sitä tosiasiaa, että ARC-kortti muodostaa korkeamman oligomeerisen kompleksin FAS DD: n tai FADD DD: n kanssa estoprosessin aikana, ei voida jättää huomiotta. Tässä tapauksessa, laaja pinta KAARIKORTIN jäämiä leviää kaikkien viiden helices sen rakenne olisi voinut osallistua kokoonpano estävä monimutkainen. Kompleksisen rakenteen ratkaisemiseen tarvitaan lisätoimia, jotta saadaan selkeämpi käsitys Arc: n eston molekulaarisesta perustasta. On kuitenkin raportoitu, että ARC-kortin homo-dimerisaatio aiheutti Arc: n estävän aktiivisuuden menetyksen, mikä osoittaa, että ehdotettu mallimme komplekseista Fas DD: llä ja FADD: llä on tarkka. Nykyisessä tutkimuksessa havaitun proteiinin yhteisvaikutusrajapinnan paljastaminen saattaa olla kriittistä vuorovaikutukselle muiden sitovien kumppaneiden kanssa ARC: n asianmukaisen estotoiminnan kannalta apoptoosin ja nekroptoosin aikana.

ARC ilmenee näkyvästi sydän-ja luustolihassoluissa ja estää mitoottisten lihassolujen apoptoottisen solukuoleman. ARC: n osallistuminen kardiomyopatiaan stressitilanteissa havaittiin hiirimallissa40, mikä viittaa siihen, että ARC saattaa olla tiiviisti yhteydessä ihmisten sydänsairauksiin. ARC: n neuronaalisen solukuoleman estotoimintaa raportoitiin myös hiiritutkimuksessa41, mikä viittaa siihen, että ARC saattaa olla kriittinen ihmisen hermorappeumasairauksille. Pahanlaatuisissa kasvaimissa esiintyy usein suuria kaaren ilmentymiä, mikä viittaa siihen, että se saattaa olla välttämätöntä kasvaimen kehittymisen ja etenemisen kannalta. Tässä suhteessa ARC voisi olla kriittinen molekyyli, joka voi kontrolloida apoptoottista ja nekroottista solukuolemaa; vastaavasti Arc: n toiminnan kontrolloimattomuus johtaa kuolemaan johtavaan sairauteen ihmisillä. Siksi ARC saattaa olla hyvä kohde hoidollisille toimenpiteille ja tässä tutkimuksessa esitelty Arc-KORTTIRAKENNE saattaa olla ensimmäinen askel ARC-KORTTIVÄLITTEISTEN proteiinien vuorovaikutusten ja sen inhibitorisen kapasiteetin ymmärtämisessä. Pienet molekyylit, jotka voivat ohjata ARC: n toimintaa kohdistamalla homo – ja heteroligomeeriseen rajapintaan, saattavat olla hyviä apoptoottisen ja nekroottisen solukuoleman säätelijöitä ja siten potentiaalisia lääkeaihioita.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.