A kaszpáz toborzó domén (CARD) kristályszerkezete az apoptózis represszor CARD-dal (ARC) és annak hatása az apoptózis gátlására

az ARC CARD kristályszerkezete

az ARC gátolja mind a belső, mind a külső apoptózis utakat a különböző apoptózissal rokon fehérjékkel való kölcsönhatás révén, beleértve a FAS-t, az Fadd-t és a kaszpáz-8-at (ábra. 1A). Az ARC kártya doménről ismert, hogy a FAS DD-vel, FADD DD-vel és kaszpáz-8 ded-ekkel való közvetlen kölcsönhatás révén zavarja a LEMEZKÉPZŐDÉST (ábra. 1A) 29.

az ARC (ARC CARD) KÁRTYATARTOMÁNYÁNAK 2,4 MHz-es kristályszerkezetét egy hullámhosszú anomális diffrakciós (SAD) módszerrel oldottuk meg, és 17,0% – os Rwork-re és 20,0% – os Rfree-re finomítottuk. Az ARC kártya nagy felbontású szerkezete azt mutatta, hogy öt hélixet tartalmaz, H1-H5, ami nem a DD szupercsalád tipikus hajtása (ábra. 1B). Érdekes módon a hatodik hélixet (H6) nem észlelték a tipikus helyen, ami azt jelzi, hogy a H6 rugalmas lehet az ARC KÁRTYATARTOMÁNYÁBAN, vagy hurokszerkezetet alkalmazhat helyette. Az aszimmetrikus egységben két monomer volt, az A és a B lánc (ábra. 1C). Az A lánc modellje az 5. maradékból a 87. maradékba, a 91. maradékból a 93. maradékba épült, míg a B lánc modellje az 5.maradékból a 84. maradékba épült. A feltételezett H6 (88-tól 93-ig) nem modellezhető a gyenge elektronsűrűség-térkép miatt (ábra. 1B). Mindegyik monomer majdnem azonos volt, és 0-os RMSD-t kapott.5 6 (Kiegészítő Ábra. 1). Bár a KÁRTYATARTOMÁNY H6 rendkívüli formájáról számoltak be NOD1 KÁRTYASZERKEZETTEL, ez az első jelentés, amely azt mutatja, hogy a H6 nem létezik a KÁRTYATARTOMÁNYBAN. Az ARC kártya H6 régiójának aminosav-szekvenciája nem tipikus hélixszekvencia, összehasonlítva más Kártyákéval (ábra. 1D). Az ÍVKÁRTYA feltételezett H6 régióját (PDPAWDWQH) a másodlagos szerkezet-előrejelzési program alapján véletlenszerű tekercshuroknak jósolták, jelezve, hogy a H6 nem létezik az ÍVKÁRTYÁBAN, ehelyett egy hurok váltotta fel. A KÁRTYATARTOMÁNY ezen atipikus szerkezete az első eset, amelyet a haláltartomány szupercsaládjában figyeltek meg. A H3 hossza rövidebb volt, mint a többi hélixé, ami a halál domén szupercsalád közös jellemzője. Az ÍVKÁRTYA N és C végpontja a molekula ugyanazon oldalán helyezkedik el. A H1-től H5-ig terjedő hélixköteget szorosan csomagolta egy központi hidrofób mag, amely I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 és L77 (ábra. 1E). Az ARC CARD hidrofób klaszterét alkotó magban eltemetett maradványok nincsenek jól konzerválva, de a leggyakoribbak a különböző kártyák között, ami azt jelzi, hogy az ARC CARD lehet az egyik legkompaktabb és legstabilabb fehérje a halál domén szupercsalád között (ábra. 1D). Az ARC kártya rendkívül kompakt és rendezett tulajdonságát az alacsony átlagos B-tényező, 57,9 6(1.táblázat) mutatja.

1. táblázat adatgyűjtési és finomítási statisztikák

az ARC kártya központi részének szerkezeti merevsége és az arc kártya kísérletileg rendezetlen H6 régiója olyan különálló jellemzők, amelyek kritikusak lehetnek az ARC funkcióihoz, amelyeket különböző kölcsönhatásban lévő fehérjék közvetítenek, beleértve a TNF receptort, az FADD-t, a BAD-ot és a BAX-ot. Az ARC CARD a halál domén szupercsalád egyetlen tagja, amely kölcsönhatásba léphet a szupercsalád különböző alcsaládjaival, valamint a Bcl-2 család fehérjéivel. Az ARC különböző kötő partnerek befogadására való képessége és a rendezetlen, merev ARC CARD maggal rendelkező H6 közötti kapcsolatot a jövőbeli vizsgálatok során meg kell vizsgálni.

Dimer interfész az ÍVKÁRTYÁN belül

méret-kizárási kromatográfia és többszögű fényszórás (MALS) azt jelezte, hogy az izolált ÍVKÁRTYA dimerként viselkedik az oldatban (ábra. 2A). Az ARC kártya számított monomer molekulatömege, beleértve a C-terminális his-tag-et, 11,763 Da volt, a Mals számított molekulatömege pedig 21,901 Da (0,9% illesztési hiba), 1,000 polidiszperzitással (ábra. 2A). Felvetődött, hogy az ARC a kártyán keresztül homo-dimert képezhet, és hogy az ARC kártya által közvetített dimerizációja megszünteti anti-apoptotikus potenciálját29. Kristályszerkezetünk az ÍVKÁRTYA dimer formáját is támogatja oldatban. A halál domén szupercsalád dimerizációja, beleértve a CARD-ot is,nem meglepő,mert számos tanulmány kimutatta, hogy a DD szupercsalád homo-dimerizálható oldatban24, 33, 34. Az ARC CARD homo-dimer szerkezete érdekes betekintést nyújt a homo-dimer interfészekbe. Az aszimmetrikus egység két ÍVKÁRTYÁJA aszimmetrikus dimerként van csomagolva, amelynek interfésze elsősorban elektrosztatikus kölcsönhatásból áll (ábra. 2B). A teljes dimer felület eltemeti 916 6-2 (a monomer felülete 458 2-2), ami 9% – a dimer felület. A fő kölcsönhatási erők a sóhidak és a hidrogénkötések, amelyeket D13 (H1-en), R56 (H4-en), R59 (H4-en) és R60 (H4) hoz létre az a láncból és D32 (H2-en), R37 (H2-en), E46 (H3-on) és D49 (H3-on) a B láncból (ábra. 2B). A peremterületen D13 a H1-en és R60 a H4-en az a lánc sóhidakat képez, R37 a H2-en és E46 a H3-on a B láncon. A határfelület középső régiójában az R56 és R59 az A lánc H4-jén sóhidakat képez, D49 a B lánc H3-án. az a lánc R59 szintén hozzájárul a D32-vel a B lánc H2-jén. Az ARC homo-dimer interakciós módja hasonló a kaszpáz-9 kártya és az APAF-1 kártya közötti hetero-dimer komplexéhez, mivel az egyik kártya molekula H1 és H4 kölcsönhatásba lép a másik kártya molekula H2 és H3-jával, elsősorban töltés-töltés kölcsönhatásokon35. Ez a fajta interakció az I. típusú interakcióhoz tartozik a halál domén szupercsaládjában észlelt három típusú interakció között14,25. Bár egy egyedülálló diszulfid kötés által közvetített homo-dimer szerkezete a kártya domén beleértve NOD1 és CARMA1 számoltak be33, 34, a jelenlegi szerkezete ARC kártya dimerizált keresztül I. típusú interfész, amely egy új módszer a homo-dimer kártya szerkezetét.

ábra 2

az ARC kártya szerkezetének dimer interfésze.

A. többszögű fényszórási (MALS) profil. A piros vonal a kísérleti molekulatömeget jelzi. B. Közeli kép a kölcsönhatásban lévő maradékokról a két monomer közötti interfészen. A hélixeket jelölik, az érintkezésben részt vevő maradványokat pedig botként mutatják be. A sóhidak szaggatott vonalakként jelennek meg.

a nagy elektrosztatikus kölcsönhatások által létrehozott ÍVKÁRTYA új homo-dimer szerkezetének elemzéséhez méretkizárási kromatográfiás és MALS kísérleteket végeztünk magas só (1,5 M NaCl) és alacsony pH (pH 3) jelenlétében, ami a karboxilátok protonálódását és a töltött kölcsönhatások megszakadását eredményezte. Ahogy az várható volt, az ARC CARD monomerré vált magas só-és alacsony pH-érték mellett (ábra. 3A és kiegészítő ábra. 2A és 2B). Mivel a D49-et, az R56-ot és az R59-et kritikus maradékanyagként azonosítottuk az új interfész kialakulásához, egy mutagenezis vizsgálatot is végeztünk az interfész elemzésére. Minden maradékot (D49, R56 és R59) ellentétes töltésekké mutáltunk, és a méretkizárási kromatográfiához és a MALS kísérletekhez használtuk. Amint az ábrán látható. 3B, a vad típusú elúciós csúcsot, amelyet a méretkizárási kromatográfia során figyeltek meg, mutációval monomer helyre helyeztük. A MALS által meghatározott molekulatömegeket és a különböző körülmények között várható sztöchiometriát az ábra foglalja össze. 3C. A MALS nyers adatait a kiegészítő ábra is mutatja. 2. A méret kizárás kromatográfia és MALS kísérlet azt mutatta, hogy a dimer ív kártya vált monomer keresztül mutációk interfész maradék D49R, R56E és R59E és kettős mutánsok (ábra. 3B és 3C és kiegészítő Fig. 2). Az oligomerizáció változásait a mutációkra adott válaszként natív oldal igazolta. A sáv mutációkkal történő lefelé tolása azt jelzi, hogy a dimer ÍVKÁRTYA oldatban monomer lett a mutációkra adott válaszként (ábra. 3D). A kenet felfelé tolódó sávjának generálása a D49R mutációval váratlan kivétel volt, amely véleményünk szerint a mutagenezis által kiváltott töltésváltozásokra adott válaszként következett be. Mivel a natív oldalon eltolt vagy újonnan előállított sávok jól jelzik a fehérje komplex megzavarását vagy képződését, a d49r által generált sáv továbbra is monomer sáv lehet. Egy másik lehetőség az, hogy a d49r dimert képez a koncentráció során. Nagy koncentrációban a gyengén megszakadt mutáns D49R dimer lett az oldatban. Mivel a kettős mutáns, D49R, R59E, monomer sávot generált (ábra. 3D), a D49R nem biztos, hogy elegendő a feltöltött interakciók megszakításához. Annak igazolására, hogy a mutációk által okozott dimer-zavar nem a mutagenezis által okozott váratlan szerkezeti változások eredménye, hanem inkább a dimer interfészt megzavaró specifikus mutációk miatt értékeltük a far UV körkörös dikroikus (CD) spektrumokat (kiegészítő ábra. S3). A CD spektrumok tipikus, 6-208 nm-es és 222 nm-es, valamint 195 nm-es maximumokkal jellemezhető, amelyek hasonlóak a vad típuséhoz, és megfelelnek a DD szupercsalád többi tagjának molekulaszerkezetének36. Ezek az eredmények megerősítették, hogy az ÍVKÁRTYA dimerizációjának megzavarását a várt módon specifikus mutagenezis okozza, de nem a mutagenezis által okozott váratlan szerkezeti változások.

ábra 3

az arc kártya homo-dimer által alkotott interfész elemzése.

A. méret kizárás kromatográfiás profilja magas só és alacsony pH állapot. B. különböző mutációk Méretkizárási kromatográfiás profilja. C. magas só, alacsony pH és mutációs hatások a dimerképződésre. A mért molekulatömeg és a várható sztöchiometria látható. D. Natív oldal. A Wt a vad típust jelzi.

együttvéve, az ARC kártya homo-dimert képez oldatban, ahogy az várható volt, amit egy korábbi in vivo kísérletben is bemutattak29, és ezt a dimerizációt az I. típusú interakció közvetíti a más halál domén szupercsalád interakciókban és a hetero-dimer kártya domén interakciókban észlelt nagy töltésű kölcsönhatásokkal. Mivel az ARC-kártya ezen homo-dimerizációja az ARC gátló aktivitásának elvesztését okozta, lehetséges, hogy az ARC-kártya ezt a homo-dimer interfészt használja más fehérjékkel való kölcsönhatáshoz. A jelenlegi vizsgálatunkban kimutatott fehérje interakciós felület feltárása elengedhetetlen az ARC funkciójának meghatározásához.

Összehasonlítás más KÁRTYASZERKEZETEKKEL

a dali37-tel végzett szerkezeti homológiai keresés azt mutatta, hogy az ARC kártya nagyon hasonló a többi kártyához. A legjobb nyolc mérkőzés, amelyek Z-pontszáma 13,8-7,7 volt, NOD1, BinCARD, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 és RAIDD (2.táblázat). Egymásra mind a kilenc kártya jelezte, hogy a struktúrák az összes kártya jól egymásra h1 H5, kivéve a H6, ami nem is észlelt a szerkezet ARC kártya (ábra. 4A). H6 nod1 kártya csatlakozik H5 és nem tört. H6 A legtöbb kártya szorosan csomagolva a központi köteg, míg H6 A NLRP1 kártya távol helyezkedik el a központi köteg (ábra. 4A).

2. táblázat szerkezeti hasonlóság keresése DALI használatával

az ÍVKÁRTYA és a többi kártya közötti páronkénti szerkezeti illesztések egyértelmű szerkezeti különbségeket és hasonlóságokat mutattak (ábra. 4B-G). Az ÍVKÁRTYÁVAL legjobban egymásra helyezett kártya NOD1 volt. Birtokában atipikus H6 volt egy érdekes tulajdonsága ARC kártya és NOD1 kártya (ábra. 4B), míg a H1 ív kártya hosszabb volt, mint a többi kártya. Az ARC kártya fragmentummaradványai alapján a kísérleti H6 elhelyezkedése hasonló az NLRP1 H6 helyéhez (ábra. 4D). A H6 szembetűnő különbségei jelzik a H6 dinamikus jellegét a különböző kártyák között. Az összes KÁRTYASZERKEZETBEN észlelt hajlított H1, beleértve az aktuális ARC kártyát is, szintén érdekes tulajdonság, amelyet csak a kártyák szerkezetén észleltek.

az ARC kártya elektrosztatikus felületén hasonló bruttó tulajdonságokkal rendelkezik, mint más kártyák. Például, hasonlóan a legtöbb más kártya töltöttségéhez, az ARC kártya felülete is pozitív és negatív töltésű tulajdonságok keverékéből áll. A töltött klaszterek a homo-dimer komplex felületén helyezkednek el. Mivel a kártyák fehérje interakciós modulok, felületi tulajdonságaik diktálják a partnerekkel való interakció módját. Az ÍVKÁRTYA elektrosztatikus felületének elemzése alapján lehetséges lehet ezt a töltött interakciót használni homo vagy hetero dimer komplex képződéshez.

konzervált felülete ARC kártya: a FAS DD-vel és az FADD DD-vel való potenciális interakció helye a LEMEZSZERELVÉNY gátlására

az ARC-kártya felületén számos olyan maradvány konzerválódik, amelyek kritikusak a homo-dimer komplex interfészének kialakulása szempontjából FAS (DD), FADD (DED) és kaszpáz-8 (az első ded), amelyek az ARC ismert kötő Partnerei (ábra. 5A). Ezek közé tartozik a D32, R37, D49, R56, R59 és R60 (ábra. 2B és 5A). A D32 mind a Fas DD-n, mind az FADD DD-n konzerválódik, míg a D49 az FADD DD-n, a kaszpáz-8 ded1-en, az R60 pedig a FAS DD-n és a kaszpáz-8 ded1-en konzerválódik. Az R37 és R59 csak a Fadd DD-nél konzerválódik, míg az R56 csak a kaszpáz-8 DED1-nél. D13 és E46, amelyek kritikus maradványok képződését a homo-dimer komplex ARC kártya, nem konzervált egyáltalán (ábra. 5A).

ábra 5

a lemezképződés ívkártyával történő gátlásának molekuláris alapjának modellje.

A. az ARC kártya szekvenciális igazítása a kötő partnereivel, a Fas DD-vel, az FADD DD-vel és a kaszpáz-8 ded-vel. Az ARC kártya homo-dimer kölcsönhatása szempontjából kritikus maradványok a felület egyik oldalán kékek, a másik oldalon pedig pirosak voltak. A FAS DD, FADD DD és kaszpáz-8 ded konzervált maradékai szintén vörös vagy kék színűek. B. a felső panel a halál domén szupercsalád komplexek három típusú kölcsönhatásának sematikus diagramját mutatja. DDS: halál domain szupercsalád. Az alsó panel a kaszpáz-9 kártya (Casp-9)/APAF-1 komplex szerkezetét mutatja, amely az I. típusú interakció által alkotott reprezentatív kártya:kártya interakció. C. az ARC kártya és a Fas DD közötti interakció modellje. Azok a maradványok, amelyek részt vehetnek az interakcióban, botokként jelennek meg. D. az ARC kártya és az Fadd DD közötti interakció modellje. Azok a maradványok, amelyek részt vehetnek az interakcióban, botokként jelennek meg.

hat egyedi interfészen (IA, Ib, IIa, IIb, IIIa és IIIb típusok) három típusú interakciót azonosítottak a haláldomén szupercsaláddal való kölcsönhatásokban (ábra. 5B) 14,38. A tipikus heterodimer interakciót a card doménnel a kaszpáz-9 kártya és az APAF-1 kártya komplex kristályszerkezete alapján azonosítottuk, az interakciót pedig az I. típusú interakciók képezték35. Az Ia típusú felületet elsősorban a H1 és H4 hélixek maradékai alkotják, és kölcsönhatásba lép az Ib típusú felülettel, amelyet főleg a H2 és H3 hélixek maradékai képeznek (ábra. 5B).

a FAS DD-vel vagy FADD DD-vel való interakció során az ARC-kártya homo-dimer komplexének kialakulása szempontjából kritikus konzervált maradványok szekvenciaillesztése, korábban megoldott KÁRTYAKOMPLEX szerkezete és elhelyezkedése alapján kifejlesztettünk egy kísérleti gátló modellt az ARC-kártya számára. Mivel a D13, R56, R59 és R60, amelyek kritikus maradványok az ARC kártya homo-dimer interfészének egyik oldalának kialakulásához, nem viszonylag konzerváltak a Fas DD és FADD DD-ben, az ARC kártya ezen oldalát használták kísérleti interakciós helyként. A Fas DD-t vagy a FADD DD-t ezután a másik oldalon található ÍVKÁRTYÁRA helyezték, hogy I. típusú interakciót hajtsanak végre. Az ARC: Fas komplex modell azt mutatta, hogy az ARC kártyáról származó R56, R59 és R60 masszív feltöltött interakciót képez a D261 és az E256 FAS DD-vel (ábra. 5C). Az ÍVKÁRTYA D13-a szintén részt vehet az interakcióban, ha sóhidat képez a Fas DD K301-jével. Az ARC: Fadd komplex modell esetében a D123 és D127 az Fadd DD H3-ból részt vehetett az ARC kártya alapjavításával (R56, R59 és R60) való interakcióban (ábra. 5D). A MODELLSZERKEZETEK interfészei szerkezetileg és energetikailag is kedvezőek voltak a PISA interfészelemző program39 szerint.

az ív-és utóvizsgálatok első homo-dimer KÁRTYASZERKEZETE a KORONGSZERKEZET ív által közvetített molekuláris gátló mechanizmusára utal, amely az extrinsic apoptosis jelátviteli út kritikus jelátviteli molekuláris komplexe. Mivel a multimer kártya domén komplex RIG-1 és MAVS, amelyek mindhárom típusú interakciót használják, amelyeket a halál domén alcsalád összeállításához észleltek, nemrégiben számoltak be, nem lehet figyelmen kívül hagyni azt a tényt, hogy az ARC kártya magasabb oligomer komplexet képez Fas DD-vel vagy FADD DD-vel a gátlási folyamat során. Ebben az esetben az ÍVKÁRTYA kiterjedt felülete, amelynek szerkezete mind az öt spirálján átterjedt maradványok részt vehettek a gátló komplex összeszerelésében. További erőfeszítésekre van szükség a komplex szerkezet megoldására, hogy tisztább betekintést nyerjünk az ív általi gátlás molekuláris alapjába. Azonban arról számoltak be, hogy az ARC kártya homo-dimerizációja az ARC gátló aktivitásának elvesztését okozta, jelezve, hogy a FAS DD és FADD komplexek javasolt modellje pontos. A jelenlegi vizsgálatban kimutatott fehérje interakciós interfész feltárása kritikus lehet a más kötő partnerekkel való kölcsönhatás szempontjából az ARC megfelelő gátló funkciója szempontjából apoptózis és necroptosis alatt.

az ARC jelentős mértékben expresszálódik a szív-és vázizomsejtekben, és megakadályozza a poszt-mitotikus izomsejtek apoptotikus sejthalálát. Egérmodellben megfigyelték az ARC bevonását a kardiomiopátiába stressz körülmények között40, jelezve, hogy az ARC szorosan kapcsolódhat az emberek szívbetegségeihez. Az ARC neuronális sejthalálának gátló funkciójáról egy egérvizsgálatban41 is beszámoltak, jelezve, hogy az ARC kritikus lehet az emberek neurodegeneratív betegségei szempontjából. Rosszindulatú daganatokban gyakran megfigyelhető az ARC magas expressziója, ami arra utal, hogy ez elengedhetetlen lehet a tumor fejlődéséhez és progressziójához. Ebben a vonatkozásban az ARC kritikus molekula lehet, amely képes szabályozni az apoptotikus és nekrotikus sejthalált; ennek megfelelően az ARC funkciójának ellenőrzésének elmulasztása halálos betegséghez vezet az emberekben. Ezért az ARC jó célpont lehet a terápiás beavatkozáshoz, és az ebben a tanulmányban bemutatott ARC CARD struktúra lehet az első lépés az ARC CARD által közvetített fehérje kölcsönhatások és gátló képességének megértéséhez. Azok a kis molekulák, amelyek a homo – és hetero-oligomer interfészt célozva képesek szabályozni az ARC aktivitását, jó szabályozói lehetnek az apoptotikus és nekrotikus sejthalálnak, ezért potenciális gyógyszerjelöltek.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.