La proteina brm umana viene scissa durante l’apoptosi: Il ruolo della catepsina G

Risultati e discussione

Il trattamento delle cellule NB-4 con irradiazione UV provoca la scissione di hbrm e PARP (Fig. 1A) e frammentazione del DNA (dati non mostrati). PARP è un substrato noto delle caspasi apoptotiche (18). La proteina 180-kDa hbrm viene scissa in un prodotto 160-kDa più piccolo ad una velocità quasi identica a quella della scissione PARP. Il trattamento delle cellule NB4 con agenti dannosi per il DNA (etoposide o camptothecin) o staurosporine ha anche indotto apoptosi e scissione di hbrm al frammento 160-kDa (Fig. 1 TER). Gli anticorpi anti-hbrm sollevati contro il terminale amminico di hbrm sono in grado di rilevare il frammento di hbrm 160-kDa (Fig. 1), mentre gli anticorpi anti-hbrm sollevati contro il terminale carbossilico di hbrm non riconosceranno questo frammento 160-kDa (dati non mostrati). Questi risultati indicano che il terminale carbossilico di hbrm è stato rimosso dalla scissione apoptotica.

Figura 1

Le proteine brm e PARP sono degradate nelle cellule NB4 sottoposte ad apoptosi. (A) Le cellule NB4 sono state trattate con 100 J/m2 di UV e poi lisate nei momenti successivi al trattamento indicati sopra le corsie. I lisati cellulari sono stati utilizzati per Western blotting con anticorpi anti-brm e anti-PARP. (B) Le cellule sono state trattate per 2 ore con etoposide, camptothecin o staurosporine alle concentrazioni indicate e poi lisate per Western blotting.

Si ritiene generalmente che i substrati apoptotici nucleari come hbrm siano scissi da caspasi “effettori”, come caspasi-3 o caspasi-7, che vengono attivati nelle fasi finali dell’apoptosi e entrano nei nuclei per fendere i substrati proteici. Per determinare se caspasi-3 o caspasi-7 fosse in grado di scindere la proteina hbrm, i nuclei isolati di HeLa sono stati incubati con caspasi-3 o caspasi-7 purificati attivi. I nuclei sono stati poi repelleted e utilizzati per fare estratti di proteine nucleari. Gli estratti nucleari sono stati utilizzati per Western blot con anticorpi a tre proteine note per essere scisse in vivo durante l’apoptosi: PARP, chinasi DNA-dipendente (DNA-PK) 350-kDa subunità, e la proteina NuMA, così come per hbrm Western. Sebbene la caspasi-7 tagli PARP e DNA-PK p350 più rapidamente della caspasi-3, sia la caspasi-3 che la caspasi-7 tagliano tutti e tre i substrati apoptotici nucleari (Fig. 2 BIS). Tuttavia, la proteina hbrm non è stata scissa da caspasi-3 o caspasi-7 (o caspasi-6, dati non pubblicati). Sebbene questo sia un sistema in vitro, ciò suggerisce che hbrm è scisso da un’altra proteasi, che è in grado di entrare nel nucleo durante l’apoptosi, o si trova nel nucleo.

Figura 2

Incubazione di nuclei cellulari HeLa con caspasi e catepsine purificate e attive. (A) I nuclei delle cellule HeLa sono stati preparati e risospesi in 100 µl di tampone di omogeneizzazione come descritto in Materiali e metodi. Quindi 100 ng di caspasi-3 o caspasi-7 purificati e attivi sono stati aggiunti a ciascun campione 100-µl e i campioni sono stati incubati a 30°C per i tempi indicati sopra le corsie. I campioni di controllo sono stati incubati 2 h a 30°C senza aggiunta di caspasi. Subito dopo l’incubazione, i nuclei sono stati repelleted e poi lisati in un piccolo volume di tampone di lisi Nonidet P-40 per 30 min a 4°C. I lisati Nonidet P-40 sono stati eliminati dal DNA ruotando 10 min a 10.000 × g e quindi utilizzati per Western blotting. (B) I nuclei di HeLa sono stati incubati a 30°C per 2 ore in tampone, HeLa cytosol o NB4 cytosol, come indicato sopra le corsie. (C) I nuclei sono stati incubati con tampone, catepsina G purificata, catepsina D o elastina come indicato.

Poiché la proteina hbrm viene scissa durante l’apoptosi nelle cellule NB4, ma non viene scissa dalle solite caspasi effettore, sembrava possibile che hbrm fosse scisso da una proteasi specifica per le cellule NB4. Per testare questa ipotesi, i nuclei di HeLa sono stati incubati con citosol privo di detersivo da cellule NB4 non trattate o cellule HeLa. Fico. 2B mostra che solo il citosol NB4 conteneva un’attività che scindeva la proteina hbrm. Le proteasi diverse dalle caspasi sono state implicate nell’esecuzione dell’apoptosi in cellule NB4 o neutrofili, comprese le catepsine (19, 20), sebbene le catepsine non abbiano precedentemente dimostrato di fendere substrati nucleari. Per vedere se le proteasi dei neutrofili hanno avuto alcun effetto sulla scissione di hbrm, i nuclei di HeLa sono stati incubati con catepsina D purificata, catepsina G o elastina. Solo la catepsina G è stata in grado di fendere hbrm (Fig. 2C); la catepsina G ha quasi completamente ridotto la proteina hbrm a un frammento di 160-kDa, molto simile per dimensioni a quella prodotta dal citosol NB4 e osservata in vivo durante l’apoptosi. Per verificare che la catepsina G fosse presente nel citosol NB4 ed era responsabile della scissione di hbrm, il citosol NB4 era impoverito della catepsina G mediante immunoprecipitazione ripetuta; il citosol impoverito risultante era molto meno attivo su hbrm quando incubato con nuclei HeLa (dati non pubblicati).

Per determinare se la catepsina G fosse necessaria per la scissione di hbrm in vivo, le cellule NB4 sono state pretrattate con lo specifico inibitore della catepsina G CK-08 (carbobenzossi-glicil-leucil-fenilalanil-clorometilchetone) o con il più generale inibitore della serina proteasi l-1-tosilammido-2-feniletil clorometilchetone. Le cellule sono state poi irradiate ai raggi UV, e incubato un ulteriore 4 h. Campione di cellule lisati sono stati poi analizzati da Western blot (Fig. 3). Come mostrato nella parte superiore della Fig. 3, la catepsina G inibitore CK – 08 quasi completamente bloccato hbrm scissione in risposta all’irradiazione UV, mentre l-1-tosylamido-2-feniletil clorometil chetone ha avuto poco effetto. È anche chiaro che CK-08 non agisce bloccando alcuni passaggi a monte della risposta apoptotica, come l’attivazione della caspasi. Come mostrato nella parte inferiore della Fig. 3, CK-08 non solo non riesce a bloccare l’attivazione della caspasi in risposta all’irradiazione UV, ma CK-08 stesso, in contrasto con l-1-tosylamido-2-phenylethyl chlorometyl chetone, è un potente attivatore delle caspasi. Caspasi-9, caspasi-3 (Fig. 4), e caspase-7 (non mostrato) sono tutti scissi e attivati in cellule trattate con CK-08 da solo o con CK-08 seguito da irradiazione UV. La proteina PARP viene anche scissa da 112 kDa a 85 kDa nelle cellule trattate con CK-08, mostrando che le caspasi attivate entrano nel nucleo in queste cellule(Fig. 3). Questi risultati indicano che CK-08 deve bloccare direttamente la scissione della catepsina G di hbrm o bloccare una via apoptotica alternativa che dipende dall’attività della catepsina G e non coinvolge le caspasi. In considerazione del fatto che la catepsina G purificata fende hbrm in vitro in modo simile a quello osservato in vivo, la prima possibilità sembra più probabile.

Figura 3

Effetto degli inibitori della serina proteasi sulla scissione dell’hbrm e sull’attivazione delle caspasi. Le cellule NB4 sono state lasciate non trattate, pretrattate per 30 min con un inibitore della catepsina G da 5 µM CK-08 (Z-Gly-Leu-Phe-CK) o pretrattate per 30 min con il più generale inibitore della serina proteasi l-1-tosilammido-2-feniletil clorometil chetone (TPCK) come indicato sopra le corsie. I campioni non trattati e trattati con inibitori sono stati quindi irradiati ai raggi UV e incubati per ulteriori 4 ore (con inibitori della proteasi aggiunti ai campioni appropriati). I lisati a cellule intere sono stati quindi preparati come descritto in Materiali e metodi e utilizzati per l’analisi Western blot con anticorpi alle proteine indicate a sinistra.

Figura 4

La scissione brm murina endogena è migliorata dall’eccessiva espressione della catepsina G umana nelle cellule murine 32D. (A) Le cellule murine 32D trasfettate stabilmente con vettore vuoto o vettore che esprime catepsina G umana sono state irradiate ai raggi UV e poi lisate nei momenti successivi all’irradiazione indicati sopra le corsie. I lisati cellulari sono stati quindi utilizzati per l’analisi Western blot con anticorpi anti-catepsina G. (B) I lisati 32D dello stesso esperimento mostrato in A sono stati utilizzati per l’analisi Western blot con anticorpi anti-hbrm. Sono indicate le posizioni di brm murino endogeno a lunghezza intera (180 kDa) e prodotto di scissione (160 kDa).

Per confermare che l’espressione della catepsina G influisce sulla scissione di hbrm in vivo, la scissione di hbrm è stata esaminata in linee cellulari mieloidi 32D murine (21) trasfettate stabilmente con vettore vuoto o vettore che esprime catepsina G umana (Fig. 4 BIS). Le cellule 32D, come altre cellule dipendenti da IL-3, non subiranno un’apoptosi completa a meno che non siano affamate per IL-3 (22); in presenza di IL-3, le cellule 32D sottoposte a irradiazione UV entreranno nelle prime fasi dell’apoptosi, quindi si riprenderanno. Fico. 4B mostra i livelli endogeni di brm del topo in cellule 32D dopo irradiazione UV ma senza fame di IL-3. Le cellule 32D trasfettate con catepsina G umana hanno chiaramente livelli più bassi di brm endogeno a lunghezza intera (180 kDa) e livelli più elevati di prodotto di scissione brm (160 kDa); questo è evidente in tutte le condizioni.

Se la catepsina G fende effettivamente hbrm in vivo, deve essere rilasciata dai granuli e avere accesso alle proteine nucleari. Per osservare la distribuzione subcellulare della catepsina G nelle cellule NB4, le cellule sono state filate su vetrini, quindi ottenute utilizzando anticorpi anti-catepsina G e LisoTracker (il LisoTracker è un peptide permeabile alle cellule fluorescente che si accumula selettivamente in organelli acidi come i lisosomi). Come mostrato in Fig. 5A, gli anticorpi anti-catepsina G colorano molto intensamente strutture specifiche nelle cellule NB4. La struttura simile al cappuccio, che è macchiata dagli anticorpi anti-catepsina G ma non dal LisoTracker, è probabilmente l’apparato di golgi. Le aree circolari più piccole sono quasi certamente granuli perché peptide LysoTracker si accumula anche in loro (vedi Fig. 5 BIS). Come dimostrato dalla colorazione DAPI, le cellule NB4 contengono nuclei molto grandi e un volume relativamente piccolo di citoplasma. Come controllo, le cellule HeLa-S3, che crescono in sospensione e sono simili per dimensioni e forma alle cellule NB4, sono state anche colorate con gli anticorpi anti-catepsina G. Come si vede in Fig. 5B, quasi nessuna colorazione delle cellule HeLa-S3 da anticorpi anti-catepsina G è osservata. Per determinare se la catepsina G subisce alcun cambiamento nella posizione subcellulare durante l’apoptosi, le cellule NB4 sono state irradiate con raggi UV. Dopo 1 ora LysoTracker è stato aggiunto alle cellule irradiate; dopo un’ora supplementare le cellule sono state filate su vetrini e fissati. Le cellule sono state colorate utilizzando gli anticorpi anti-catepsina G, quindi montati con supporti contenenti DAPI. Le cellule apoptotiche sono state identificate dalla loro forma irregolare e dalla cromatina condensata. Come dimostrato dalla colorazione DAPI raggruppata, Fig. 5C mostra due cellule apoptotiche NB4. Rispetto alla Fig. 5A, il modello sia della catepsina G che della colorazione del LysoTracker è chiaramente diverso, diventando più diffuso e associato al nucleo. Questo cambiamento nella distribuzione subcellulare 2 h dopo l’irradiazione supporta l’idea che la struttura dei granuli viene interrotta durante l’apoptosi e le proteine dei granuli, come la catepsina G, possono muoversi nel nucleo e fendere le proteine nucleari.

Figura 5

Colorazione delle cellule NB4 e HeLa-S3 con anticorpi anti – catepsina G o LisoTracker. (A) Le cellule NB4 sono state incubate per 1 ora a 37°C in supporti contenenti 50 µM di peptide LysoTracker e poi filate su vetrini utilizzando un citocentrifugo. Dopo la fissazione in formalina tamponata neutra seguita dal lavaggio, le cellule sono state incubate prima con anticorpi anti-catepsina G e poi con anticorpi secondari marcati con FITC. Le celle sono state preparate per la visualizzazione al microscopio con l’aggiunta di supporti di montaggio contenenti DAPI e coprioggetti. Le fotografie mostrano DAPI più catepsina G colorazione, DAPI più LysoTracker, DAPI da solo, catepsina G da solo, o LysoTracker da solo, come indicato. B) Le cellule HeLa-S3 sono state preparate come in A ma non sono state incubate con LysoTracker. C) Le cellule NB4 sono state irradiate ai raggi UV come descritto in Materiali e metodi; 1 ora dopo l’irradiazione, 50 µM LysoTracker è stato aggiunto al supporto cellulare. Dopo un’ulteriore ora di incubazione, le cellule sono state filate su un vetrino. Dopo il fissaggio e la colorazione con anticorpi anti-catepsina G, le cellule sono state montate utilizzando un mezzo contenente DAPI. La forma cellulare e la condensazione della cromatina sono state utilizzate per distinguere le cellule apoptotiche da quelle non apoptotiche.

Sebbene la catepsina G sembri essere coinvolta nella scissione di hbrm nelle cellule NB4, la catepsina G è normalmente espressa solo in alcune cellule mieloidi (neutrofili, macrofagi, mastociti e loro precursori). Ciò solleva la questione dei cambiamenti nei livelli di hbrm osservati in altri tipi di cellule. Fico. 6 presenta prove che l’hbrm può essere degradato dall’attività del proteasoma. L’inibitore specifico del proteasoma lactacystin provoca un aumento dei livelli di proteina hbrm in entrambe le cellule NB4 e COS-7 (Fig. 6A), suggerendo un tasso basale di ubiquitinazione e degradazione di hbrm esiste in entrambi i tipi di cellule. Per verificare che hbrm sia ubiquinato, le cellule COS-7 sono state cotrasfettate con plasmidi che esprimono hbrm HA-tagged e ubiquitina 6-His-tagged. I lisati delle cellule trasfettate sono stati quindi incubati con agarosio acido Ni-nitrilotriacetico e le proteine legate eluite e utilizzate per l’analisi Western blot con anticorpi anti-HA. Hbrm si è legato all’agarosio dell’acido Ni-nitriloacetico ma solo quando il plasmide hbrm con etichetta HA è stato cotrasfettato con il plasmide 6-His-ubiquitina (Fig. 6 TER). I risultati sopra descritti suggeriscono che la degradazione di hbrm nelle cellule senza catepsina G, e forse la degradazione di hbrm nelle cellule NB4 che si verifica dopo la scissione da parte della catepsina G, è mediata dal proteasoma. Il livello di ubiquitinilazione di hbrm non sembra aumentare dopo l’irradiazione UV (i nostri dati non pubblicati); tuttavia, questo non indica necessariamente che la via ubiqutina non sia importante nella degradazione di hbrm. Altri gruppi (24, 25) hanno proposto degradazione apoptotica mediata dal proteasoma, ma non hanno mostrato aumenti rilevabili nel substrato ubiquiato durante l’apoptosi. È possibile che l’apoptosi determini un aumento dell’attività sia degli enzimi ubiquinanti che delle proteasi del proteasoma, causando una degradazione proteica più rapida senza aumenti rilevabili delle proteine ubiquinate.

Figura 6

Il proteasoma è coinvolto nella degradazione dell’hbrm. (A) Le cellule NB4 o le cellule COS-7 sono state trattate con lattacistina da 20 µM per 4 ore o non trattate. Le cellule sono state poi lisate per l’analisi occidentale. (B) Le cellule COS-7 sono state trasfettate con plasmide hbrm con tag HA più vettore vuoto o con plasmide hbrm con tag HA più vettore che esprime l’Ubiquitina 6-His, come indicato sopra le corsie. Entrambi i campioni cellulari sono stati lisati, incubati con agarosio acido Ni-nitrilotriacetico per il legame delle proteine 6-His-tagged e quindi proteine legate elutizzate con EDTA 150 mm. Le proteine eluite sono state utilizzate per l’analisi Western blot con anticorpi anti-HA tag.

Poiché sia la catepsina G che il proteasoma sembrano essere coinvolti nella scissione di hbrm nelle cellule NB4, sorge la domanda su quale ruolo ciascuno giochi nella degradazione in vivo della catepsina G. La regione del terminale carbossilico rimosso dalla scissione della catepsina G contiene un bromodominio (Fig. 7A), che si ritiene mediare l’interazione proteina-proteina (9). Ciò suggerisce che la scissione di hbrm può interrompere le interazioni normali fra hbrm ed altre proteine nucleari. Per determinare se la scissione della catepsina G influisce sull’associazione della proteina hbrm con le strutture nucleari, sono stati utilizzati esperimenti di frazionamento subcellulare per esaminare il grado in cui l’hbrm a lunghezza intera rispetto al frammento di hbrm 160-kDa è stato in grado di rimanere associato al nucleo. Le cellule NB4 sono state irradiate con UV, e poi in vari momenti in seguito sono state frazionate in citosol e nuclei mediante lisi detergente rapida come descritto in Materiali e metodi (Fig. 7 TER). In contrasto con full-length 180-kDa hbrm, dove la maggior parte delle proteine è rimasta strettamente associata al nucleo, tutti i frammenti di hbrm 160-kDa rilevabili sono stati trovati nel citosol (Fig. 7 TER). Questo è in contrasto con il frammento di scissione apoptotica PARP 85-kDa, che rimane nel nucleo. Questi risultati indicano chiaramente che la scissione di ≈20 kDa dal terminale carbossilico di hbrm provoca l’interruzione di un’interazione tra hbrm e qualche altra proteina nucleare, portando alla perdita di una stretta associazione con il nucleo. Inoltre può provocare l’accessibilità aumentata al proteasoma, facilitante ulteriore degradazione apoptotica. È ragionevole suggerire che hbrm debba essere associato ad altre proteine nucleari nella cromatina per svolgere la sua normale funzione, e questo modello è supportato da studi di associazione BRG-1 con cromatina (15). La proteina BRG-1 è altamente omologa a hbrm e quando i linfociti sono stimolati usando ionomycin o phorbol 12-myristate 13-acetate, BRG-1 si associa più strettamente con la cromatina.

Figura 7

Il frammento di scissione hbrm da 160 kDa è meno fortemente associato ad altre proteine nucleari rispetto all’hbrm a lunghezza intera. (A) Diagramma dei domini hbrm e del sito di scissione della catepsina G. (B) Le cellule NB4 sono state irradiate con UV, e poi in vari momenti dopo irradazione le cellule sono state frazionate in citosol e nuclei mediante lisi rapida detergente (vedi Materiali e metodi). Entrambe le frazioni sono state utilizzate per l’analisi Western blot con anticorpi anti-hbrm e anti-PARP.

In sintesi, le cellule NB4 rispondono sia all’irradiazione UV che al trattamento con staurosporina con rapida scissione del carbossil-terminale 20 kDa della proteina hbrm contenente un bromodominio, con conseguente perdita di stretta associazione con strutture nucleari. A differenza della maggior parte dei substrati apoptotici nucleari, l’hbrm non viene scisso dalla caspasi-3, -6 o -7. La catepsina G della serina proteasi scinde hbrm in vitro e un inibitore della catepsina G, ma non altri inibitori della serina proteasi, può bloccare la scissione indotta dai raggi UV di hbrm in vivo. La sovraespressione indotta della catepsina umana G nelle cellule murine 32D aumenta il livello di scissione di hbrm osservato dopo irradiazione UV. Questi risultati suggeriscono che l’hbrm viene scisso nelle cellule NB4 dalla catepsina G rilasciata dai granuli cellulari durante l’apoptosi. Abbiamo anche osservato che la catepsina G scinderà le proteine PARP, NuMA e DNA-PK p350 in vitro (dati non pubblicati). Tuttavia, a differenza dei risultati osservati con hbrm, il modello di digestione è dissimile da quello osservato in vivo. Il modello di digestione in vivo di queste proteine assomiglia invece a quello generato in vitro dalle caspasi. Inoltre, la scissione in vivo di PARP non è bloccata dall’inibitore della catepsina G CK – 08 (Fig. 3). Per questi motivi, riteniamo che i substrati apoptotici nucleari PARP, NuMA e DNA-PK p350, a differenza di hbrm, siano scissi in vivo da caspasi-3 o -7.

La discussione di cui sopra suggerisce che alcune cellule ematopoietiche, come i neutrofili, possono possedere un metodo unico per la rapida inattivazione della proteina hbrm in risposta al danno al DNA causato da radiazioni UV o altri agenti. Il possesso di un tale meccanismo potrebbe rendere le cellule soggette a rapida apoptosi dopo aver subito danni al DNA; le cellule di topi privi del gene hbrm subiscono infatti un maggior grado di apoptosi dopo irradiazione UV (17). Inoltre, è stato dimostrato che il complesso proteico contenente hbrm fa parte di un complesso repressore che inibisce la trascrizione dei geni per le cicline E e A, inducendo così l’arresto della crescita nella fase G1 del ciclo cellulare (9). Nelle cellule staminali mieloidi o nelle cellule leucemiche, l ‘inattivazione dell’ hbrm potrebbe influenzare l ‘attività di questo complesso repressore, prevenendo così l’ arresto della crescita in risposta al danno al DNA. Questo a sua volta potrebbe garantire che le cellule contenenti danni al DNA subirebbero apoptosi piuttosto che arresto della crescita.

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