struktura krystaliczna domeny rekrutującej kaspazę (CARD) represora apoptozy z kartą (ARC) i jej implikacja w hamowaniu apoptozy

struktura krystaliczna karty ARC

ARC hamuje zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne szlaki apoptozy poprzez interakcję z różnymi powiązanymi z apoptozą białka, w tym FAS, Fadd i kaspaza-8 (fig. 1a). Wiadomo, że domena karty ARC zakłóca tworzenie dysku poprzez bezpośrednią interakcję z Fas DD, Fadd DD i kaspazą-8 Ded(Fig. 1A) 29.

struktura krystaliczna 2,4 Å domeny karty ARC (karty ARC) została rozwiązana przy użyciu metody anomalnej dyfrakcji o pojedynczej długości fali (Sad) i udoskonalona do Rwork 17,0% i Rfree 20,0%. Struktura karty ARC o wysokiej rozdzielczości pokazała, że składa się z pięciu Helis, od H1 do H5, co nie jest typowym fałdem nadrodziny DD (rys. 1B). Co ciekawe, szósta helisa (H6) nie została wykryta w typowym miejscu, co wskazuje, że H6 może być elastyczny w domenie karty łuku lub przyjąć zamiast tego strukturę pętli. W jednostce asymetrycznej znajdowały się dwa monomery, łańcuch A i łańcuch B (rys. 1C). Model łańcucha a został zbudowany z pozostałości 5 do pozostałości 87 i pozostałości 91 do pozostałości 93, podczas gdy łańcuch B został zbudowany z pozostałości 5 do pozostałości 84. Przypuszczalny H6 (od reszty 88 do 93) nie mógł być modelowany ze względu na słabą mapę gęstości elektronów (Fig. 1B). Każdy monomer był prawie identyczny i nałożony na RMSD równe 0.5 Å (Uzupełnienie Rys. 1). Chociaż odnotowano niezwykłą formę h6 domeny karty ze strukturą karty NOD1, jest to pierwszy raport pokazujący, że H6 nie istnieje w domenie karty. Sekwencja aminokwasowa regionu H6 karty łukowej nie jest typową sekwencją helisy w porównaniu z sekwencją innych kart (Fig. 1D). Przypuszczalny region H6 karty ARC (PDPAWDWQH) był przewidywany jako losowa pętla cewki w oparciu o program przewidywania struktury wtórnej, wskazujący, że H6 nie istnieje w karcie ARC i został zastąpiony przez pętlę. Ta nietypowa struktura domeny karty jest pierwszym przypadkiem zaobserwowanym wśród nadrodziny domeny śmierci. Długość H3 była krótsza niż u innych Helis, co jest wspólną cechą nadrodziny domeny śmierci. Końcówki N I C Karty łukowej znajdują się po tej samej stronie cząsteczki. Wiązka helisy od H1 do H5 była szczelnie upakowana przez centralny hydrofobowy rdzeń składający się z I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 i L77 (rys. 1e). Pozostałości Zakopane w rdzeniu tworzącym hydrofobowy klaster karty ARC nie są dobrze zachowane, ale są najbardziej obfite wśród różnych kart, co wskazuje, że karta ARC może być jednym z najbardziej zwartych i stabilnych białek wśród nadrodziny domeny śmierci (Fig. 1D). Bardzo kompaktowa i uporządkowana cecha karty ARC pokazuje niski średni współczynnik B wynoszący 57,9 Å2(Tabela 1).

Tabela 1 statystyki dotyczące gromadzenia i udoskonalania danych

sztywność strukturalna rdzeniowej części karty ARC i wstępnie nieuporządkowany region H6 karty ARC są odrębnymi cechami, które mogą być krytyczne dla funkcji ARC, które są pośredniczone przez różne interakcyjne białka, w tym receptor TNF, FADD, BAD I BAX. Karta ARC jest jedynym członkiem nadrodziny domeny śmierci, który może wchodzić w interakcje z różnymi podrodzinami w nadrodzinie, a także z białkami rodziny Bcl-2. Związek między zdolnością łuku do przyjmowania różnych partnerów wiążących a nieuporządkowanym H6 ze sztywnym rdzeniem karty łuku powinien zostać zbadany w przyszłych badaniach.

interfejs dimera w karcie ARC

chromatografia wykluczająca rozmiar i rozproszenie światła o wielu kątach (MALS) wykazały, że izolowana karta ARC zachowuje się jak dimer w roztworze (rys. 2A). Obliczona monomeryczna Masa cząsteczkowa karty łukowej, w tym c-terminala His-tag, wynosiła 11,763 Da, a obliczona Masa cząsteczkowa z MALS wynosiła 21,901 Da (błąd dopasowania 0,9%), z polidyspersyjnością 1,000 (Fig. 2A). Zasugerowano, że łuk może tworzyć homo-dimer za pośrednictwem karty, a dimeryzacja łuku za pośrednictwem karty znosi jego potencjał anty-apoptotyczny29. Nasza struktura krystaliczna obsługuje również dimeryczną formę karty łukowej w roztworze. Dimeryzacja nadrodziny domeny śmierci, w tym karty,nie jest zaskakująca,ponieważ wiele badań wykazało, że Nadrodzina DD może być homo-dimeryzowana w rozwiązaniu24, 33, 34. Homo-dimeryczna struktura karty ARC zapewnia interesujący wgląd w interfejsy homo-dimeryczne. Dwie karty łukowe w jednostce asymetrycznej są pakowane jako asymetryczny dimer z interfejsem złożonym głównie z oddziaływania elektrostatycznego (rys. 2b). Całkowita powierzchnia dimeru zawiera 916 Å2 (Powierzchnia monomeru wynosi 458 Å2), co stanowi 9% powierzchni dimeru. Głównymi siłami oddziaływań są Mostki solne i wiązania wodorowe, które są wytwarzane przez D13 (na H1), R56 (na H4), R59 (na H4) i R60 (H4) z łańcucha a oraz przez D32 (na H2), R37 (na h2), E46 (na H3) I D49 (na h3) z łańcucha B (rys. 2b). W regionie peryferyjnym, D13 na H1 i R60 na H4 łańcucha a tworzą Mostki solne z R37 na H2 I E46 na H3 łańcucha B, odpowiednio. W centralnym obszarze interfejsu R56 i R59 na H4 łańcucha a tworzą Mostki solne z D49 na H3 łańcucha B. R59 łańcucha A przyczynia się również do tworzenia mostu solnego z D32 na H2 łańcucha B. Tryb interakcji homo-dimeru łukowego jest podobny do hetero-dimerycznego kompleksu między kartą kaspazy-9 i kartą APAF-1 w tym, że H1 i H4 jednej cząsteczki karty oddziałują z H2 I H3 drugiej cząsteczki karty, głównie poprzez interakcje ładunek-ładowanie35. Ten rodzaj interakcji należy do interakcji typu I wśród trzech rodzajów interakcji wykrytych w superrodzinie domeny śmierci 14,25. Chociaż opisano unikalną homo-dimeryczną strukturę homo-dimeryczną domeny kart,w tym NOD1 i CARMA1, opartą na wiązaniu dwusiarczkowym, 33,34, obecna struktura karty ARC została dimeryzowana za pomocą interfejsu typu I, który jest nowatorską metodą homo-dimerycznej struktury karty.

Rysunek 2

Dimeryczny interfejs struktury karty ARC.

A. profil rozproszenia światła o wielu kątach (MALS). Czerwona linia oznacza eksperymentalną masę cząsteczkową. B. Widok Z Bliska oddziałujących pozostałości w interfejsie między dwoma monomerami. Helisy są oznakowane, a pozostałości zaangażowane w Kontakt są pokazane jako pałeczki. Mosty solne są pokazane jako przerywane linie.

aby przeanalizować nową homo-dimeryczną strukturę karty łuku powstałą w wyniku dużych oddziaływań elektrostatycznych, przeprowadziliśmy eksperymenty z chromatografią wykluczającą rozmiar i MALS w obecności wysokiej soli (1,5 M NaCl) i niskiego pH (pH 3), co spowodowało protonację karboksylanów i zakłócenie oddziaływań naładowanych. Zgodnie z oczekiwaniami, karta ARC stała się monomerem w warunkach wysokiej soli i niskiego pH (rys. 3a i dodatkowe rys. 2A i 2b). Ponieważ D49, R56 i R59 są zidentyfikowane jako krytyczne pozostałości do tworzenia tego nowego interfejsu, przeprowadziliśmy również badanie mutagenezy w celu analizy interfejsu. Każda pozostałość (D49, R56 i R59) została zmutowana do przeciwnych ładunków i wykorzystana do chromatografii wykluczającej rozmiar i eksperymentów MALS. Jak pokazano na Fig. 3b, pik elucyjny typu dzikiego obserwowany po chromatografii wykluczającej Rozmiar został przeniesiony do monomerycznego miejsca przez mutację. Masy cząsteczkowe określone przez MALS i oczekiwaną stechiometrię w różnych warunkach podsumowano na fig. 3C. Surowe dane dla MALS są również pokazane na fig. uzupełniającym. 2. Chromatografia wykluczająca rozmiar i eksperyment MALS wykazały, że dimeryczna karta Łukowa stała się monomerem poprzez mutacje reszty interfejsu D49R, R56E i R59E oraz podwójnych mutantów (Fig. 3b i 3C oraz dodatkowe rys. 2). Zmiany w oligomeryzacji w odpowiedzi na mutacje zostały potwierdzone przez native-PAGE. Przesunięcie pasma w dół przez mutacje wskazuje, że dimeryczna karta Łukowa stała się monomeryczna w roztworze w odpowiedzi na mutacje (rys. 3D). Generowanie pasma rozmazywania przez mutację d49r było nieoczekiwanym wyjątkiem, który naszym zdaniem wystąpił w odpowiedzi na zmiany ładunku wywołane mutagenezą. Ponieważ przesunięte lub nowo wytworzone pasma na stronie natywnej są dobrymi wskaźnikami zakłócenia lub tworzenia kompleksu białkowego, pasmo generowane przez D49R może nadal być pasmem monomerowym. Inną możliwością jest to, że D49R tworzy dimer podczas koncentracji. Przy wysokim stężeniu słabo zaburzony mutant d49r stał się dimerem w roztworze. Ponieważ podwójny mutant, D49R, R59E, generował pasmo monomeryczne (rys. 3D), D49R może nie wystarczyć do przerwania naładowanych interakcji. Aby potwierdzić, że zaburzenie dimeru przez mutacje nie było wynikiem nieoczekiwanych zmian strukturalnych spowodowanych mutagenezą, ale raczej z powodu specyficznych mutacji, które mogą zakłócić interfejs dimeryczny, oceniliśmy widmo dichroiczne kołowe far UV (CD) (uzupełniające rys. S3). Widmo CD wykazywało typowe białka α-spiralne, z dwoma wyraźnymi minimami przy 208 nm i 222 nm oraz maksymami przy 195 nm, które są podobne do dzikiego typu i pasowały do struktury molekularnej innych członków nadrodziny DD well36. Wyniki te potwierdziły, że zakłócenie dimeryzacji karty łukowej jest spowodowane specyficzną mutagenezą, zgodnie z oczekiwaniami, ale nie nieoczekiwanymi zmianami strukturalnymi powstałymi w wyniku mutagenezy.

Rysunek 3

Analiza interfejsu tworzonego przez homo-dimer karty ARC.

A. profil chromatografii wykluczającej wielkość wysokiej soli i niskiego pH. B. profil chromatografii wykluczającej różne mutacje. C. Wysoka sól, niskie pH i wpływ mutacji na tworzenie dimerów. Przedstawiono zmierzoną masę cząsteczkową i oczekiwaną stechiometrię. D. Native-PAGE. Wt oznacza typ wild.

łącznie karta ARC tworzy homo-dimer w roztworze, zgodnie z oczekiwaniami, co wykazano w poprzednim eksperymencie in vivo 29 i ta dimeryzacja jest pośredniczona przez interakcję typu I z wysoce naładowanymi interakcjami wykrywanymi w innych interakcjach nadrodzinnych domeny śmierci i interakcjach Hetero-dimerycznych domeny karty. Ponieważ ta homo-dimeryzacja karty ARC spowodowała utratę aktywności hamującej ARC, możliwe jest, że karta ARC wykorzystuje ten homo-dimeryczny interfejs do interakcji z innymi białkami. Ujawnienie interfejsu interakcji białek, który został wykryty w naszych aktualnych badaniach, jest niezbędne do określenia funkcji łuku.

porównanie z innymi strukturami kart

badanie homologii strukturalnej za pomocą DALI37 wykazało, że karta ARC jest bardzo podobna do innych kart. Osiem najlepszych meczów, które miały wyniki Z od 13,8 do 7,7, to NOD1, BinCARD, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 i RAIDD (Tabela 2). Nałożenie wszystkich dziewięciu kart wskazało, że struktury wszystkich kart są dobrze nałożone przez H1 do H5, z wyjątkiem H6, który nie został nawet wykryty w strukturze karty łuku (rys. 4a). H6 karty NOD1 jest podłączony do H5 i nie załamany. H6 większości kart jest szczelnie zapakowany w centralny pakiet, podczas gdy H6 karty NLRP1 znajduje się daleko od centralnego pakietu (rys. 4a).

Tabela 2 wyszukiwanie podobieństwa strukturalnego przy użyciu DALI

wyrównania strukturalne między kartą ARC a innymi kartami wykazały wyraźne różnice strukturalne i podobieństwa (rys. 4B-G). Kartą najlepiej nałożoną z kartą ARC był NOD1. Posiadanie nietypowego H6 było interesującą cechą karty ARC i karty NOD1 (rys. 4B), podczas gdy H1 karty ARC był dłuższy niż w przypadku innych kart. Na podstawie pozostałości fragmentu karty łukowej, lokalizacja h6 jest podobna do lokalizacji H6 nlrp1 (Fig. 4D). Widoczne różnice w H6 wskazują na dynamiczny charakter H6 wśród różnych kart. Gięty H1 wykryty we wszystkich strukturach kart, w tym obecnej karcie ARC, jest również interesującą cechą, która została wykryta tylko na strukturze kart.

karta ARC ma podobne cechy w swojej powierzchni elektrostatycznej jak inne karty. Na przykład, podobnie jak w przypadku większości innych kart, powierzchnia karty ARC składa się również z mieszaniny dodatnio i ujemnie naładowanych cech. Skupiska naładowane znajdują się na styku kompleksu homo-dimerycznego. Ponieważ karty są białkowymi modułami interakcji, ich cechy powierzchniowe decydują o sposobie interakcji z partnerami. Na podstawie analizy powierzchni elektrostatycznej karty łukowej możliwe jest wykorzystanie tego oddziaływania naładowanego do tworzenia kompleksów homo-lub hetero-dimerycznych.

zachowana powierzchnia karty łuku: potencjalne miejsce interakcji z FAS DD i Fadd DD w celu zahamowania zespołu dysku

na Fas (DD), Fadd (DED) i caspase-8 (pierwszy DED), które są znanymi partnerami wiążącymi ARC (Fig. 5A). Należą do nich D32, R37, D49, R56, R59 i R60 (rys. 2B i 5A). D32 jest konserwowany w Fas DD i Fadd DD, podczas gdy D49 jest konserwowany w Fadd DD i caspase-8 DED1, a R60 jest konserwowany w FAS DD i caspase-8 DED1. R37 i R59 są konserwowane tylko w FADD DD, podczas gdy R56 jest konserwowany tylko w kaspazie – 8 DED1. D13 i E46, które są krytycznymi pozostałościami do tworzenia homo-dimerycznego kompleksu karty łukowej, nie są w ogóle konserwowane (rys. 5A).

Rysunek 5

Model molekularnej podstawy hamowania tworzenia dysku przez kartę łuku.

A. wyrównanie sekwencji karty ARC z jej partnerami wiążącymi, FAS DD, Fadd DD i caspase-8 DED. Pozostałości krytyczne dla homo-dimerycznego oddziaływania karty łukowej były niebieskie dla jednej strony powierzchni i czerwone dla drugiej strony. Zachowane pozostałości na Fas DD, Fadd DD i caspase-8 DED są również pokazane jako czerwone lub niebieskie. B. górny panel przedstawia schematyczny schemat trzech rodzajów interakcji w kompleksach nadrodzinnych domeny śmierci. DDS: death domain superfamily. Dolny panel przedstawia strukturę kompleksu caspase – 9 CARD(Casp-9) / APAF-1, reprezentatywnej karty: interakcji karty utworzonej przez interakcję typu I. C. Model interakcji między kartą ARC a FAS DD. Pozostałości, które mogą uczestniczyć w interakcji, są pokazane jako pałeczki. D. Model interakcji między kartą ARC a Fadd DD. Pozostałości, które mogą uczestniczyć w interakcji, są pokazane jako pałeczki.

trzy rodzaje interakcji (typy I, II I III) w sześciu unikalnych interfejsach (typy Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa i IIIb) zostały zidentyfikowane w interakcjach z nadrodziną domeny śmierci (Fig. 5B) 14,38. Typowa interakcja heterodimeryczna z domeną kart została zidentyfikowana przez strukturę krystaliczną kompleksu kart kaspazy-9 i kart APAF-1, a interakcja została utworzona przez interakcje typu I35. Powierzchnia typu Ia jest przede wszystkim utworzona przez pozostałości na helisach H1 i H4 i współdziała z powierzchnią typu Ib, która jest głównie utworzona przez pozostałości na helisach H2 i H3 (Fig. 5b).

opierając się na wyrównaniu sekwencji, wcześniej rozwiązanej strukturze złożonej karty i lokalizacji konserwowanych pozostałości krytycznych dla utworzenia homo-dimerycznego kompleksu karty ARC, opracowaliśmy wstępny model hamujący karty ARC poprzez interakcję z FAS DD lub Fadd DD. Ponieważ D13, R56, R59 i R60, które są krytycznymi pozostałościami dla tworzenia jednej strony homo-dimerycznego interfejsu karty ARC, nie są stosunkowo zachowane w FAS DD i Fadd DD, ta strona karty ARC została użyta jako wstępne miejsce interakcji. Fas DD lub Fadd DD został następnie nałożony na kartę ARC znajdującą się po drugiej stronie, aby dokonać interakcji typu I. Złożony model ARC:FAS wykazał, że R56, R59 i R60 z karty ARC tworzą masywną interakcję z D261 i E256 z FAS DD (rys. 5C). D13 karty ARC może być również zaangażowany w interakcję poprzez utworzenie mostu solnego z K301 Fas DD. W przypadku ARC:Fadd complex model, D123 i D127 z H3 Fadd DD mogły uczestniczyć w interakcji z podstawową łatą (utworzoną przez R56, R59 i R60) karty ARC (rys. 5D). Interfejsy struktur modelowych były strukturalnie i energetycznie korzystne zgodnie z programem analizy interfejsów PISA39.

pierwsza homo-dimeryczna struktura karty ARC i dalsze badania sugerują molekularny mechanizm hamowania zespołu dysku, który jest krytycznym sygnałowym kompleksem molekularnym w zewnętrznym szlaku sygnałowym apoptozy. Ponieważ ostatnio doniesiono o wielomerycznym kompleksie domen kart Rig-1 i MAVS, które wykorzystują wszystkie trzy rodzaje interakcji, które zostały wykryte dla montażu podrodziny domen śmierci, nie można zignorować faktu, że karta ARC tworzy wyższy kompleks oligomeryczny z FAS DD lub Fadd DD podczas procesu hamowania. W tym przypadku rozległa powierzchnia karty łukowej z resztkami rozprzestrzeniającymi się przez wszystkie pięć Helis jej struktury mogła uczestniczyć w montażu kompleksu hamującego. Potrzebne są dalsze wysiłki w celu rozwiązania złożonej struktury, aby uzyskać jaśniejszy wgląd w molekularne podstawy hamowania przez łuk. Stwierdzono jednak, że homo-dimeryzacja karty ARC spowodowała utratę aktywności hamującej łuku, co wskazuje, że proponowany przez nas model kompleksów z Fas DD i FADD jest dokładny. Ujawnienie interfejsu interakcji białek wykrytego w obecnym badaniu może mieć kluczowe znaczenie dla interakcji z innymi partnerami wiążącymi dla prawidłowego hamowania funkcji łuku podczas apoptozy i nekroptozy.

ARC wykazuje wyraźną ekspresję w komórkach mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych i zapobiega apoptotycznej śmierci tych post-mitotycznych komórek mięśniowych. Udział ARC w kardiomiopatii w warunkach stresu zaobserwowano w modelu mysim40, co wskazuje, że ARC może być ściśle związany z chorobami serca u ludzi. Hamowanie funkcji śmierci komórek neuronalnych ARC odnotowano również w badaniu na mysiach41, co wskazuje, że ARC może mieć kluczowe znaczenie dla chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Wysoka ekspresja ARC jest często obserwowana w nowotworach złośliwych, co wskazuje, że może być niezbędna do rozwoju i progresji nowotworu. W tym aspekcie ARC może być krytyczną cząsteczką, która może kontrolować apoptotyczną i martwiczą śmierć komórek; w związku z tym brak kontroli funkcji ARC prowadzi do śmiertelnej choroby u ludzi. Dlatego ARC może być dobrym celem interwencji terapeutycznej, a struktura karty ARC przedstawiona w tym badaniu może być pierwszym krokiem do zrozumienia interakcji z białkami zależnymi od karty ARC i jej zdolności hamującej. Małe cząsteczki, które mogą kontrolować aktywność łuku poprzez ukierunkowanie homo – i hetero – oligomerycznego interfejsu, mogą być dobrymi regulatorami apoptotycznej i martwiczej śmierci komórek, a zatem potencjalnych kandydatów na leki.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.