estrutura cristalina da caspase recrutamento de domínio (CARTÃO) de apoptose repressor com CARTÃO (ARCO) e sua implicação na inibição da apoptose

estrutura cristalina do ARCO do CARTÃO de

o ARCO do inibe tanto a intrínseca e extrínseca da apoptose caminhos através da interação com diversas proteínas relacionadas a apoptose, incluindo Fas, FADD e caspase-8 (Fig. 1A). O domínio da placa de arco é conhecido por interferir com a formação do disco através da interação direta com o AFS DD, FADD DD e caspase-8 DEDs(Fig. 1A) 29.

The 2.4 Å crystal structure of The CARD domain of ARC (ARC CARD) was solved using a single-Wavel anomal difaction (SAD) method and refined to an Rwork of 17.0% and an Rfree of 20.0%. A estrutura de alta resolução do ARC CARD mostrou que ele é composto por cinco hélices, H1 A H5, que não é a dobra típica da superfamília DD (Fig. 1B). Curiosamente, a sexta hélice (H6) não foi detectada no local típico, indicando que H6 pode ser flexível no domínio da placa de arco ou adotar uma estrutura de laço em vez disso. Havia dois monômeros na unidade assimétrica, cadeia a e cadeia B (Fig. 1C). O modelo da cadeia A foi construído dos resíduos 5 aos resíduos 87 e 91 aos resíduos 93, enquanto o da cadeia B foi construído dos resíduos 5 aos resíduos 84. Putativo H6 (do resíduo 88 a 93) não poderia ser modelado devido ao mapa de densidade de elétrons pobre (Fig. 1B). Cada monômero era quase idêntico e sobreposto a um RMSD de 0.5 Å (Supplemental Fig. 1). Embora uma forma extraordinária de H6 do domínio do cartão foi relatada com uma estrutura de cartão NOD1, este é o primeiro relatório mostrando que H6 não existe no domínio do cartão. A sequência de aminoácidos da região H6 da placa de arco não é uma sequência típica de hélice quando comparada com as de outras placas (Fig. 1D). A região putativa H6 do ARC CARD (PDPAWDWQH) foi prevista para ser um loop de bobina aleatório baseado no programa de predição da estrutura secundária, indicando que H6 não existe no ARC CARD e foi substituído por um loop. Esta estrutura atípica do domínio do cartão é o primeiro caso observado entre a superfamília do domínio da morte. O comprimento de H3 era menor que o de outras hélices, que é uma característica comum do domínio da morte superfamília. A termini N E C da placa de arco reside no mesmo lado da molécula. O feixe de hélice de H1 A H5 foi fortemente embalado por um núcleo hidrofóbico central composto por I12, V20, L23, L30, L31, L34, L35, L40, L48, V58, L61, L62, L64, V65, L76 e L77 (Fig. 1E). Os resíduos enterrados dentro do núcleo formando o aglomerado hidrofóbico de cartão de arco não são bem conservados, mas são os mais abundantes entre diferentes cartões, indicando que o cartão de arco pode ser uma das proteínas mais compactas e estáveis entre a superfamília do domínio da morte (Fig. 1D). A característica altamente compacta e ordenada da ARC CARD é mostrada pelo baixo fator B médio de 57,9 Å2(Quadro 1).

Tabela 1-coleta de Dados e refinamento estatísticas

A rigidez estrutural da parte central do ARCO de CARTÃO e provisoriamente desordenado H6 região do ARCO do CARTÃO são características distintas que podem ser fundamentais para as funções de ARCO, que são mediadas por diversos interagindo proteínas, incluindo o TNF receptor, FADD, RUIM e BAX. ARC CARD é o único membro da superfamília death domain que pode interagir com diferentes subfamílias dentro da superfamília, bem como com proteínas da família Bcl-2. A relação entre a capacidade da ARC para acomodar vários parceiros vinculativos e desordenada H6 com um núcleo rígido de ARC CARD deve ser investigada em estudos futuros.

interface dímero no interior do ARC CARD

cromatografia de exclusão por Dimensão e espalhamento de luz multi-ângulo (MALS) indicaram que o arco isolado se comporta como um dímero em solução (Fig. 2A). O peso molecular monomérico calculado da placa de arco, incluindo a His-tag C-terminal, foi de 11.763 Da E o peso molecular calculado a partir de MALS foi de 21.901 Da( erro de ajuste de 0,9%), com uma polidispersibilidade de 1,000 (Fig. 2A). Tem sido sugerido que o arco pode formar um homo-dímero através do cartão e que a dimerização mediada pelo cartão do arco elimina o seu potencial anti-apoptótico 29. Nossa estrutura de cristal também suporta a forma dimérica de cartão de arco em solução. A dimerização da superfamília do domínio da morte, incluindo o CARD, não é surpreendente porque muitos estudos têm mostrado que a superfamília DD pode ser homo-dimerizada em solution24,33,34. A estrutura homo-dimérica do ARC CARD fornece uma visão interessante sobre as interfaces homo-dimeric. As duas placas de arco na unidade assimétrica são embaladas como um dímero assimétrico com uma interface composta principalmente de uma interação eletrostática (Fig. 2B). A superfície total dímero enterra 916 Å2 (uma superfície monomérica de 458 Å2), o que representa 9% da superfície dímero. As principais forças de interacção são: sal pontes e ligações de hidrogénio, que são feitas por D13 (em H1), R56 (em H4), R59 (em H4) e R60 (H4) de cadeia e por D32 (em H2), R37 (em H2), E46 (em H3) e D49 (em H3) da cadeia B (Fig. 2B). Na região periférica, D13 em H1 e R60 em H4 da cadeia a formam pontes Salinas com R37 em H2 e E46 em H3 da cadeia B, respectivamente. Na região central da interface, R56 e R59 em H4 da cadeia de Um formulário de sal pontes com D49 em H3 da cadeia B. R59 da cadeia também contribui para a formação de um sal ponte com D32 no H2, de cadeia B. O modo de interação do ARC homo-dímero é semelhante ao do complexo hetero-dimérico entre a placa caspase-9 e a placa APAF-1 na qual H1 e H4 de uma molécula interagem com H2 e H3 da outra molécula da placa, principalmente através de interações carga-carga 35. Este tipo de interação pertence à interação tipo I entre os três tipos de interações detectadas no domínio da morte superfamília 14,25. Embora uma única, bissulfeto de bond mediada homo-dimeric estrutura do CARTÃO de domínio, incluindo NOD1 e CARMA1 foi reported33,34, a atual estrutura do ARCO CARTÃO foi dimerized através de um Tipo de interface, que é um método inovador para o homo-dimeric CARTÃO de estrutura.

Figura 2

Dimeric interface da estrutura do ARCO do CARTÃO.

A. Perfil de dispersão de luz multi-ângulo (MALS). A linha vermelha indica o peso molecular experimental. B. visão de perto dos resíduos que interagem na interface entre dois monómeros. As hélices são rotuladas e os resíduos envolvidos no contacto são apresentados como paus. As pontes salgadas são mostradas como linhas tracejadas.

Para analisar o romance homo-dimeric estrutura do ARCO CARTÃO formado por grandes eletrostática medicamentosas, realizamos cromatografia de exclusão de tamanho e MALS experimentos na presença de sal elevado (1,5 M de NaCl) e o pH baixo (pH 3), o que resultou na carboxylates sendo protonated e o cobrado medicamentosas interrompido. Como esperado, ARC CARD tornou-se um monômero em condições de alto sal e baixo pH (Fig. 3A e Fig. suplementar. 2A e 2B). Como D49, R56 e R59 são identificados como resíduos críticos para a formação desta nova interface, também realizamos um estudo de mutagênese para analisar a interface. Cada resíduo (D49, R56 e R59) foi modificado para cargas opostas e usado para a cromatografia de exclusão de tamanho e experimentos MALS. Como mostrado na Fig. 3B, o pico de eluição do tipo selvagem observado na cromatografia de exclusão por tamanho foi movido para um lugar monomérico por mutação. As massas moleculares determinadas por MALS e estequiometria esperada em várias condições são resumidas na figura. 3C. Os dados brutos para MALS também são mostrados na figura suplementar. 2. The size exclusion chromatography and MALS experiment showed that the dimeric ARC CARD became a monomer via mutations of interface residue D49R, R56E and R59E and double mutants (Fig. 3B e 3C e Figo suplementar. 2). As alterações na oligomerização em resposta a mutações foram confirmadas por native-PAGE. Down-shifting of the band by mutations indicates that dimeric ARC CARD became monomeric in solution in response to mutations(Fig. 3D). A geração de uma banda de difamação pela mutação D49R foi uma excepção inesperada que acreditamos ter ocorrido em resposta às alterações de carga induzidas pela mutagénese. Devido ao fato de bandas mudadas ou recém-produzidas na native-PAGE serem bons indicadores da ruptura ou formação do complexo proteico, a banda gerada pela D49R pode ainda ser uma banda monomérica. Outra possibilidade é que o D49R forme um dímero durante a concentração. Em concentrações elevadas, o mutante d49r fracamente perturbado tornou-se numa solução mais dímica. Desde o mutante duplo, D49R, R59E, gerou uma banda monomérica (Fig. 3D), D49R pode não ser suficiente para interromper as interações carregadas. Para confirmar que a disrupção dímero por mutações não foi um resultado de mudanças estruturais inesperadas causadas por mutagênese, mas sim devido a mutações específicas que podem perturbar a interface dimérica, avaliamos o espectro circular UV distante dicróico (CD) (figura suplementar. S3). O espectro de CD exibiu proteínas α-helicoidais típicas, com dois mínimos pronunciados a 208 nm e 222 nm e um máximo a 195 nm, que é semelhante ao do tipo selvagem e corresponde à estrutura molecular de outros membros da superfamília DD well36. Estes resultados confirmaram que a ruptura da dimerização do cartão ARC é causada por mutagénese específica, como esperado, mas não pelas mudanças estruturais inesperadas formadas pela mutagénese.

Figura 3

Análise da interface formada por homo-dímero do ARCO do CARTÃO.

A. perfil cromatográfico de exclusão por dimensão de alto sal e baixo pH. B. perfil cromatográfico de exclusão por dimensão de várias mutações. C. alto sal, baixo pH e efeitos de mutação na formação de dímero. Apresenta-se a massa molecular medida e a estequiometria esperada. D. Página nativa. Wt indica tipo selvagem.

Tomados em conjunto, o ARCO do CARTÃO de formas homo-dímero em solução, como esperado, que era mostrado em um anterior, no vivo experiment29 e este dimerização é mediada por tipo eu interação com muito carregadas interações detectadas em outras morte de domínio superfamily medicamentosas e hetero-dimeric CARTÃO de domínio de interações. Uma vez que esta homo-dimerização do ARC CARD causou a perda da atividade inibitória do ARC, é possível que ARC CARD Use esta interface homo-dimérica para interagir com outras proteínas. Revelar a interface de interação proteica que foi detectada em nosso estudo atual é essencial para a determinação da função do ARC.

comparação com outras estruturas de cartões

uma pesquisa de homologia estrutural com DALI37 mostrou que o ARC CARD é muito semelhante a outros cartões. As oito melhores partidas, que tiveram Z-pontuações de 13.8 a 7.7, foram NOD1, Bencard, NLRP1, APAF-1, ICEBERG, CARMA1, RIG1 e Radd (Tabela 2). A sobreposição de todas as nove cartas indicava que as estruturas de todas as cartas estão bem sobrepostas através de H1 A H5, exceto para H6, que nem sequer foi detectado na estrutura da placa de arco (Fig. 4A). H6 do cartão NOD1 Está ligado ao H5 e não está ligado. H6 da maioria das cartas está firmemente embalado no Pacote central, enquanto H6 da carta NLRP1 está localizado longe do pacote central(Fig. 4A).

Quadro 2 Pesquisa de similaridade estrutural utilizando DALI

alinhamentos estruturais Par-Par entre ARC CARD e estes outros cartões mostraram diferenças estruturais claras e semelhanças (Fig. 4B-G). O cartão mais bem sobreposto com ARC CARD foi NOD1. Possessão de H6 atípico foi uma característica interessante de ARC CARD e NOD1 CARD(Fig. 4B), enquanto H1 de ARC CARD era mais longo do que o de outras cartas. Com base nos resíduos de fragmentos da placa de arco,a localização da tentativa H6 é semelhante à localização de H6 de NLRP1 (Fig. 4D). As diferenças visíveis em H6 indicam a natureza dinâmica de H6 entre várias cartas. O H1 bent detectado em todas as estruturas do cartão, incluindo o cartão de arco atual, é também uma característica interessante que só foi detectada na estrutura dos cartões.

ARC CARD has similar gross features in its electrostatic surface as other CARDs. Por exemplo, semelhante à natureza carregada da maioria das outras placas, a superfície da placa de arco também é composta de uma mistura de características positivas e negativamente carregadas. Os aglomerados carregados estão localizados na interface do complexo homo-dimérico. Como as placas são módulos de interação proteica, suas características de superfície ditam seu modo de interação com parceiros. Baseado na análise da superfície eletrostática da placa de arco, pode ser possível usar esta interação carregada para a formação do complexo homo ou hetero dimérico.Superfície conservada da placa de arco: potencial de interação do site com o Fas DD e FADD DD para inibição do conjunto de DISCO

Um número de resíduos na superfície do ARCO do CARTÃO, que foram identificados como essenciais para a formação da interface do homo-dimeric complexos são conservados em Fas (DD), FADD (DED) e caspase-8 (o primeiro DED), que são conhecidos ligação parceiros de ARCO (Fig. 5A). Estes incluem D32, R37, D49, R56, R59 e R60 (Fig. 2B e 5A). O D32 é conservado tanto no Fas DD quanto no FADD DD, enquanto o D49 é conservado no FADD DD e caspase-8 DED1 e o R60 é conservado no Fas DD e caspase-8 DED1. R37 and R59 are only conserved at FADD DD, while R56 is only conserved at caspase-8 DED1. D13 e E46, que são resíduos críticos para a formação do complexo homo-dimérico da placa de arco, não são conservados de todo (Fig. 5A).

Figura 5

Modelo de base molecular da inibição do DISCO formação do ARCO do CARTÃO.

A. alinhamento sequencial do ARC CARD com os seus parceiros de ligação, Fas DD, FADD DD e caspase-8 DED. Os resíduos críticos para a interação homo-dimérica do ARC CARD eram azuis para um lado da superfície e vermelhos para o outro lado. Os resíduos conservados em Fas DD, FADD DD e caspase-8 DED são também apresentados em vermelho ou azul. B. O painel superior mostra um diagrama esquemático dos três tipos de interações nos complexos superfamiliares do domínio da morte. DDS: superfamília death domain. O painel inferior mostra a estrutura do cartão caspase-9 (Casp-9)/APAF-1, um cartão representativo:interação com cartão formada por interação Tipo I. C. modelo de interacção entre ARC CARD e Fas DD. Os resíduos que podem participar na interação são mostrados como varas. D. modelo de interacção entre ARC CARD e FADD DD. Os resíduos que podem participar na interação são mostrados como varas.

Três tipos de interações (tipos I, II e III) em seis únicas interfaces (tipos Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa e IIIb) foram identificados nas interações com a morte de domínio superfamily (Fig. 5B) 14,38. A interação heterodimérica típica com o domínio do cartão foi identificada pela estrutura cristalina do cartão caspase-9 e pelo Complexo do cartão APAF-1 e a interação foi formada pelas interações do tipo i35. A superfície do tipo Ia é formada principalmente por resíduos nas hélices H1 e H4 e interage com a superfície do tipo Ib, que é formada principalmente por resíduos nas hélices H2 e H3 (Fig. 5B).

com base no alinhamento da sequência, estrutura do complexo de cartões previamente resolvida e localização dos resíduos conservados críticos para a formação do complexo homo-dimérico de ARC CARD, desenvolvemos um modelo inibitório experimental de ARC CARD interagindo com o Fas DD ou FADD DD. Porque D13, R56, R59 e R60, que são resíduos críticos para a formação de um lado da interface homo-dimérica do cartão ARC, não são relativamente conservados no Fas DD e FADD DD, este lado do cartão ARC foi usado como um local de interação tentativa. Fas DD ou FADD DD foi então sobreposto no cartão ARC localizado do outro lado para fazer uma interação Tipo I. O ARC: FAS complex model showed that R56, R59 and R60 from ARC CARD form a massive charged interaction with D261 and E256 from Fas DD(Fig. 5C). D13 de ARC CARD também pode estar envolvido na interação, formando uma ponte salina com K301 de Fas DD. No caso do ARC: FADD complex model, D123 and D127 from H3 of FADD DD might have participated in the interaction with the basic patch (formed by R56, R59 and R60) of ARC CARD (Fig. 5D). As interfaces das estruturas modelo foram estruturalmente e energeticamente favoráveis de acordo com o programa de análise de interface PISA 39.

the first homo-dimeric CARD structure of ARC and follow-up studies suggest an ARC-mediated molecular inhibitory mechanism of the DISC assembly, which is the critical signaling molecular complex in the extrinsic apoptosis signaling pathway. Desde o multimeric CARTÃO de domínio complexo do RIG-1 e MAVS, que usam todos os três tipos de interações que foram detectados para a montagem de a morte de domínio subfamília, foram recentemente relatados, o fato de que o ARCO PLACA forma uma maior procianidinas complexo Fas com DD ou FADD DD durante a inibição do processo não pode ser ignorado. Neste caso, uma extensa superfície de cartão de arco com resíduos espalhando-se através de todas as cinco hélices de sua estrutura pode ter participado na montagem do complexo inibitório. São necessários mais esforços para resolver a estrutura complexa para obter uma visão mais clara da Base molecular da inibição por arco. No entanto, tem sido relatado que a homo-dimerização do ARC CARD causou a perda da atividade inibitória do ARC, indicando que o nosso modelo proposto dos complexos com Fas DD e FADD é preciso. Revelar a interface de interacção proteica detectada no estudo actual pode ser fundamental para a interacção com outros parceiros de ligação para a função inibitória adequada do ARC durante a apoptose e a necroptose.

ARC é proeminentemente expresso nas células cardíacas e ósseas do músculo e previne a morte das células apoptóticas dessas células musculares pós-mitóticas. O envolvimento do ARC na cardiomiopatia em condições de stress foi observado num modelo de rato40, indicando que o ARC pode estar estreitamente ligado a doenças cardíacas no ser humano. A função inibitória da morte das células neuronais do ARC também foi relatada num estudo do rato 41, indicando que o ARC pode ser crítico para doenças neurodegenerativas em seres humanos. Observa-se frequentemente uma elevada expressão de arco em tumores malignos, indicando que pode ser essencial para o desenvolvimento e progressão do tumor. Neste aspecto, ARC pode ser uma molécula crítica que pode controlar a morte de células apoptóticas e necróticas; consequentemente, a falha em controlar a função de ARC leva a doença fatal em seres humanos. Por conseguinte, o ARC pode ser um bom alvo para a intervenção terapêutica e a estrutura do cartão ARC apresentada neste estudo pode ser o primeiro passo para a compreensão das interacções proteicas mediadas pelo cartão ARC e da sua capacidade inibitória. Pequenas moléculas que podem controlar a atividade do arco, visando a interface homo – e hetero-oligomérica podem ser bons reguladores da morte celular apoptótica e necrótica e, portanto, potenciais candidatos a drogas.

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